Περιεχόμενο
- Κλωνοποίηση DNA: Επισκόπηση ορισμών και διαδικασιών
- Η μέθοδος του φορέα πλασμιδίου
- Η μέθοδος αντίδρασης PCR (Αλυσίδα Πολυμεράσης)
- Χρησιμοποιώντας τον φορέα πλασμιδίου και τις μεθόδους κλωνοποίησης DNA ϋΝΑ μαζί
- Παραδείγματα κλωνοποίησης DNA για βιοτεχνολογία
- Παραδείγματα κλωνοποίησης DNA για έρευνα
- Παραδείγματα κλωνοποίησης DNA για γονιδιακή θεραπεία
Είναι δυνατή η κλωνοποίηση ολόκληρων οργανισμών όπως το Dolly τα πρόβατα, αλλά η κλωνοποίηση του DNA είναι διαφορετική. Χρησιμοποιεί τεχνικές μοριακής βιολογίας πανομοιότυπα αντίγραφα αλληλουχιών ϋΝΑ ή απλών γονιδίων.
Χρησιμοποιώντας μεθόδους γενετικής μηχανικής, αναγνωρίζονται και απομονώνονται τμήματα του γενετικού κώδικα DNA. Η κλωνοποίηση του DNA στη συνέχεια αντιγράφει τις αλληλουχίες νουκλεϊκού οξέος στα τμήματα.
Τα ταυτόσημα αντίγραφα που προκύπτουν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω έρευνα ή εφαρμογές βιοτεχνολογίας. Συχνά το γονίδιο που αντιγράφεται κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που μπορεί να αποτελέσει μέρος των ιατρικών θεραπειών. Συμπεριλαμβανομένης της τεχνολογίας DNA Κλωνοποίηση DNA υποστηρίζει την κατανόηση του τρόπου λειτουργίας των γονιδίων και του τρόπου με τον οποίο ο γενετικός κώδικας των ανθρώπων επηρεάζει τη λειτουργία του σώματος.
Κλωνοποίηση DNA: Επισκόπηση ορισμών και διαδικασιών
Η κλωνοποίηση του DNA είναι η διαδικασία της μοριακής βιολογίας για την παραγωγή ταυτόσημων αντιγράφων των τμημάτων DNA που βρίσκονται στα χρωμοσώματα που περιέχουν τον γενετικό κώδικα των προηγμένων οργανισμών.
Η διαδικασία δημιουργεί μεγάλες ποσότητες του στοχευμένες αλληλουχίες DNA. Ο σκοπός της κλωνοποίησης DNA είναι να παραχθούν οι ίδιες οι αλληλουχίες DNA στόχου ή να παραχθούν οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται στις αλληλουχίες στόχους.
Χρησιμοποιούνται οι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στην κλωνοποίηση DNA πλασμιδίου και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Στο πλασμιδίου μέθοδο, οι κλώνοι DNA κόβονται χρησιμοποιώντας ένζυμα περιορισμού για την παραγωγή θραυσμάτων DNA και τα προκύπτοντα τμήματα εισάγονται σε φορείς κλωνοποίησης που ονομάζονται πλασμίδια για περαιτέρω επικάλυψη. Τα πλασμίδια τοποθετούνται σε βακτηριακά κύτταρα τα οποία στη συνέχεια παράγουν τα αντίγραφα DNA ή τις κωδικοποιημένες πρωτεΐνες.
Στο PCR, το τμήμα των κλώνων DNA που πρόκειται να αντιγραφούν σημειώνεται με ένζυμα που ονομάζονται εναρκτήρες. Ένα ένζυμο πολυμεράσης δημιουργεί αντίγραφα του σημασμένου τμήματος του κλώνου DNA. Αυτή η μέθοδος δεν χρησιμοποιεί ένζυμα περιορισμού και μπορεί να παράγει κλωνοποιημένο DNA από μικρά δείγματα. Μερικές φορές οι δύο μέθοδοι τεχνολογίας DNA χρησιμοποιούνται μαζί για να ενσωματώσουν τα καλύτερα χαρακτηριστικά του καθενός σε μια συνολική αντίδραση.
Η μέθοδος του φορέα πλασμιδίου
Ο φορέας της μεθόδου αναφέρεται στο πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για τη συγκράτηση του τμήματος ϋΝΑ στόχου που πρόκειται να κλωνοποιηθεί. Τα πλασμίδια είναι μικρές κυκλικές αλυσίδες μη χρωμοσωματικό ϋΝΑ που βρίσκονται σε πολλούς οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων των βακτηριδίων και των ιών.
Τα βακτηριακά πλασμίδια είναι ο φορέας που χρησιμοποιείται για την εισαγωγή του τμήματος ϋΝΑ στόχου σε βακτηριακά κύτταρα για περαιτέρω επικάλυψη.
Επιλογή και απομόνωση του DNA στόχου: Πριν αρχίσει η διαδικασία κλωνοποίησης ϋΝΑ, οι αλληλουχίες ϋΝΑ πρέπει να ταυτοποιηθούν, ειδικά τις αρχές και τα άκρα των τμημάτων DNA.
Τέτοιες αλληλουχίες ϋΝΑ μπορούν να βρεθούν χρησιμοποιώντας υπάρχον κλωνοποιημένο ϋΝΑ με γνωστές αλληλουχίες ή με μελέτη της πρωτεΐνης που παράγεται από την αλληλουχία ϋΝΑ στόχου. Μόλις είναι γνωστή η αλληλουχία, μπορούν να χρησιμοποιηθούν τα αντίστοιχα περιοριστικά ένζυμα.
Κοπή του στοχευόμενου DNA με ένζυμα περιορισμού: Τα ένζυμα περιορισμού επιλέγονται για να αναζητήσουν τον κώδικα DNA στην αρχή και στο τέλος των αλληλουχιών στόχων.
Όταν τα περιοριστικά ένζυμα βρουν μια ειδική κωδικοποιημένη αλληλουχία ζευγών βάσεων που ονομάζονται θέσεις περιορισμού, αυτοί προσκολλώνται στο DNA σε αυτή τη θέση και ανεβάζουν τον εαυτό τους γύρω από το μόριο DNA, κόβοντας το σκέλος. Τα κομμένα τμήματα ϋΝΑ που περιέχουν την αλληλουχία στόχο είναι τώρα διαθέσιμα για επικάλυψη.
Επιλέγοντας τον φορέα πλασμιδίου και εισάγοντας το ϋΝΑ στόχο: Ένα κατάλληλο πλασμίδιο περιέχει ιδανικά τις ίδιες ακολουθίες κωδικοποίησης ϋΝΑ με τον κλώνο DNA από τον οποίο κόπηκε το ϋΝΑ στόχος. Ο κυκλικός κλώνος DNA του πλασμιδίου κόβεται με τα ίδια ένζυμα περιορισμού όπως χρησιμοποιήθηκαν για την κοπή του ϋΝΑ στόχου.
ΕΝΑ Ένζυμο λιγάσης ϋΝΑ χρησιμοποιείται για να προάγει τη σύνδεση του τμήματος ϋΝΑ και τα άκρα του τμήματος ϋΝΑ στόχου συνδέονται με τα κομμένα άκρα του πλασμιδιακού ϋΝΑ. Το στοχευόμενο ϋΝΑ σχηματίζει τώρα τμήμα του κυκλικού κλώνου DNA πλασμιδίου.
Εισαγωγή του πλασμιδίου σε ένα βακτηριακό κύτταρο: Μόλις το πλασμίδιο περιέχει την αλληλουχία DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί, η πραγματική κλωνοποίηση μπορεί να λάβει χώρα χρησιμοποιώντας μια διαδικασία που ονομάζεται βακτηριακό μετασχηματισμό. Τα πλασμίδια εισάγονται σε ένα βακτηριακό κύτταρο όπως το Ε. Coli και τα κύτταρα με τα νέα τμήματα ϋΝΑ θα αρχίσουν να παράγουν αντίγραφα και τις αντίστοιχες πρωτεΐνες.
Στον μετασχηματισμό των βακτηρίων, τα κύτταρα-ξενιστές και τα πλασμίδια επωάζονται μαζί σε θερμοκρασία σώματος για περίπου 12 ώρες. Τα κύτταρα απορροφούν ορισμένα από τα πλασμίδια και τα επεξεργάζονται ως το δικό τους DNA πλασμιδίου.
Συγκομιδή του κλωνοποιημένου DNA και πρωτεϊνών: Τα περισσότερα πλασμίδια που χρησιμοποιούνται για κλωνοποίηση DNA έχουν γονίδια αντοχής στα αντιβιοτικά ενσωματωμένο στο DNA τους. Καθώς τα βακτηριακά κύτταρα απορροφούν τα νέα πλασμίδια, γίνονται ανθεκτικά στα αντιβιοτικά.
Όταν η καλλιέργεια υποβάλλεται σε αγωγή με αντιβιοτικά, επιβιώνουν μόνο εκείνα τα κύτταρα που έχουν απορροφήσει τα νέα πλασμίδια. Το αποτέλεσμα είναι μια καθαρή καλλιέργεια βακτηριακών κυττάρων με κλωνοποιημένο DNA. Αυτό το DNA μπορεί στη συνέχεια να συλλεχθεί ή να παραχθεί η αντίστοιχη πρωτεΐνη.
Η μέθοδος αντίδρασης PCR (Αλυσίδα Πολυμεράσης)
Η μέθοδος PCR είναι απλούστερη και αντιγράφει το υπάρχον DNA στη θέση του. Δεν απαιτεί κοπή με ένζυμα περιορισμού ή εισαγωγή αλληλουχιών DNA πλασμιδίου. Αυτό το καθιστά ιδιαίτερα κατάλληλο για κλωνοποίηση δειγμάτων DNA με περιορισμένο αριθμό κλώνων DNA. Ενώ η μέθοδος μπορεί να κλωνοποιήσει το DNA, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή της αντίστοιχης πρωτεΐνης.
Αποσύνδεση των κλώνων DNA: Το DNA σε χρωμοσώματα είναι σπειροειδώς σε δομή διπλής έλικας. Θέρμανση του DNA σε 96 βαθμούς Κελσίου σε μια διαδικασία που ονομάζεται μετουσίωση κάνει το μόριο του DNA να ξετυλίγεται και να χωρίζεται σε δύο κλώνους. Αυτός ο διαχωρισμός απαιτείται επειδή μόνο ένας κλώνος DNA μπορεί να κλωνοποιηθεί ταυτόχρονα.
Επιλογή των εκκινητών: Όπως με την κλωνοποίηση ϋΝΑ φορέα πλασμιδίου, οι αλληλουχίες DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθούν πρέπει να ταυτοποιηθούν με ιδιαίτερη έμφαση στις αρχές και στα άκρα των τμημάτων DNA. Οι εκκινητές είναι ένζυμα που προσκολλώνται σε συγκεκριμένες ακολουθίες κώδικα DNA και πρέπει να επιλεγούν για να επισημανθούν τα τμήματα ϋΝΑ στόχου. Οι δεξιότεροι εκκινητές θα προσκολληθούν στις ακολουθίες μορίων ϋΝΑ για να σηματοδοτήσουν τις αρχές και τα άκρα των τμημάτων στόχων.
Ανασύνδεση της αντίδρασης για δέσμευση των εκκινητών: Ψύχεται η αντίδραση σε περίπου 55 βαθμούς Κελσίου ανόπτηση. Καθώς η αντίδραση ψύχεται, οι εκκινητές ενεργοποιούνται και προσκολλώνται στον κλώνο DNA σε κάθε άκρο ενός τμήματος ϋΝΑ στόχου. Οι εκκινητές δρουν μόνο ως δείκτες και δεν χρειάζεται να κοπεί ο κλώνος DNA.
Παραγωγή ταυτόσημων αντιγράφων του τμήματος DNA στόχου: Σε μια διαδικασία που ονομάζεται επέκταση, το θερμό ευαίσθητο ένζυμο πολυμεράσης ΤΑΟ προστίθεται στην αντίδραση. Η αντίδραση στη συνέχεια θερμαίνεται στους 72 βαθμούς Κελσίου, ενεργοποιώντας το ένζυμο. Το δραστικό ένζυμο ϋΝΑ πολυμεράσης συνδέεται με τους εκκινητές και αντιγράφει την αλληλουχία ϋΝΑ μεταξύ τους. Η διαδικασία αρχικής αλληλούχησης DNA και κλωνοποίησης είναι πλήρης.
Αύξηση της απόδοσης κλωνοποιημένου DNA: Η διαδικασία αρχικής ανόπτησης και επέκτασης δημιουργεί σχετικά λίγα αντίγραφα των διαθέσιμων τμημάτων κλώνου DNA. Για να αυξηθεί η απόδοση μέσω επιπρόσθετου αναδιπλασιασμού ϋΝΑ, η αντίδραση ψύχεται και πάλι για να ενεργοποιήσει εκ νέου τους εκκινητές και αφήστε τους να δεσμευτούν σε άλλες ίνες DNA.
Στη συνέχεια, η επαναθέρμανση της αντίδρασης ενεργοποιεί πάλι το ένζυμο πολυμεράσης και παράγονται περισσότερα αντίγραφα. Αυτός ο κύκλος μπορεί να επαναληφθεί 25 έως 30 φορές.
Χρησιμοποιώντας τον φορέα πλασμιδίου και τις μεθόδους κλωνοποίησης DNA ϋΝΑ μαζί
Η μέθοδος φορέα πλασμιδίου βασίζεται σε μια άφθονη αρχική παροχή DNA για κοπή και ένθεση σε πλασμίδια. Πολύ μικρό αρχικό ϋΝΑ έχει ως αποτέλεσμα λιγότερα πλασμίδια και μια αργή έναρξη κλωνοποιημένης παραγωγής ϋΝΑ.
Η μέθοδος PCR μπορεί να παράγει μια μεγάλη ποσότητα DNA από λίγους αρχικούς κλώνους DNA, αλλά επειδή το DNA δεν εμφυτεύεται σε βακτηριακό κύτταρο, η παραγωγή πρωτεΐνης δεν είναι δυνατή.
Για να παραχθεί η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται στα θραύσματα DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθούν από ένα μικρό αρχικό δείγμα DNA, οι δύο μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν μαζί και μπορούν αλληλοσυμπληρώνονται. Πρώτα, η μέθοδος PCR χρησιμοποιείται για να κλωνοποιήσει το DNA από ένα μικρό δείγμα και να παράγει πολλά αντίγραφα.
Στη συνέχεια, τα προϊόντα PCR χρησιμοποιούνται με τη μέθοδο φορέα πλασμιδίου για εμφύτευση του παραγόμενου DNA σε βακτηριακά κύτταρα που θα παράγουν την επιθυμητή πρωτεΐνη.
Παραδείγματα κλωνοποίησης DNA για βιοτεχνολογία
Η μοριακή βιολογία χρησιμοποιεί κλωνοποίηση γονιδίων και αναδιπλασιασμό DNA για ιατρικούς και εμπορικούς σκοπούς. Τα βακτήρια με κλωνοποιημένες αλληλουχίες DNA χρησιμοποιούνται για την παραγωγή φαρμάκων και την αντικατάσταση ουσιών που οι άνθρωποι με γενετικές διαταραχές δεν μπορούν να παράγουν οι ίδιοι.
Τυπικές χρήσεις περιλαμβάνουν:
Η βιοτεχνολογία χρησιμοποιεί επίσης τη γονιδιακή κλωνοποίηση στη γεωργία για να δημιουργήσει νέα χαρακτηριστικά στα φυτά και τα ζώα ή να ενισχύσει τα υπάρχοντα χαρακτηριστικά. Καθώς κλωνοποιούνται περισσότερα γονίδια, ο αριθμός των πιθανών χρήσεων αυξάνεται εκθετικά.
Παραδείγματα κλωνοποίησης DNA για έρευνα
Τα μόρια του DNA αποτελούν ένα μικρό κλάσμα του υλικού σε ένα ζωντανό κύτταρο και είναι δύσκολο να απομονωθούν οι επιδράσεις των πολλών γονιδίων. Οι μέθοδοι κλωνοποίησης DNA δίνουν μεγάλες ποσότητες μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA για μελέτη και το DNA παράγει πρωτεΐνες όπως ακριβώς έκανε και στο αρχικό κύτταρο. Η κλωνοποίηση DNA καθιστά δυνατή την μελέτη αυτής της λειτουργίας για διαφορετικά γονίδια μεμονωμένα.
Τυπικές εφαρμογές έρευνας και τεχνολογίας DNA περιλαμβάνουν την εξέταση:
Όταν περισσότερες αλληλουχίες ϋΝΑ κλωνοποιούνται, είναι ευκολότερο να βρεθούν και να κλωνοποιηθούν επιπλέον αλληλουχίες. Τα υπάρχοντα κλωνοποιημένα τμήματα ϋΝΑ μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να καθοριστεί αν ένα νέο τμήμα ταιριάζει με το παλαιό και ποια τμήματα είναι διαφορετικά. Ο προσδιορισμός μιας αλληλουχίας στόχου DNA είναι τότε πιο γρήγορος και ακριβέστερος.
Παραδείγματα κλωνοποίησης DNA για γονιδιακή θεραπεία
Σε γονιδιακή θεραπεία, ένα κλωνοποιημένο γονίδιο παρουσιάζεται στα κύτταρα ενός οργανισμού του οποίου το φυσικό γονίδιο είναι κατεστραμμένο. Ένα ζωτικό γονίδιο που παράγει μια πρωτεΐνη που απαιτείται για μια συγκεκριμένη λειτουργία του οργανισμού θα μπορούσε να μεταλλαχθεί, να μεταβληθεί με ακτινοβολία ή να επηρεαστεί από ιούς.
Όταν το γονίδιο δεν λειτουργεί σωστά, μια σημαντική ουσία λείπει από το κύτταρο. Η γονιδιακή θεραπεία προσπαθεί αντικαταστήστε το γονίδιο με μια κλωνοποιημένη έκδοση που θα παράγει την απαιτούμενη ουσία.
Η γονιδιακή θεραπεία είναι ακόμη πειραματική και λίγοι ασθενείς έχουν θεραπευτεί χρησιμοποιώντας την τεχνική. Τα προβλήματα έγκεινται στην ταυτοποίηση του μοναδικού γονιδίου που είναι υπεύθυνο για μια ιατρική κατάσταση και στην παροχή πολλών αντιγράφων του γονιδίου στα σωστά κύτταρα. Καθώς η κλωνοποίηση του DNA έχει γίνει πιο διαδεδομένη, η γονιδιακή θεραπεία έχει εφαρμοστεί σε διάφορες ειδικές καταστάσεις.
Πρόσφατες επιτυχημένες εφαρμογές περιελάμβαναν:
Η γονιδιακή θεραπεία είναι μία από τις πιο ελπιδοφόρες εφαρμογές της κλωνοποίησης DNA, αλλά άλλες νέες χρήσεις είναι πιθανό να πολλαπλασιαστούν καθώς μελετώνται περισσότερες αλληλουχίες DNA και προσδιορίζεται η λειτουργία τους. Η κλωνοποίηση DNA αποδίδει την πρώτη ύλη για γενετική μηχανική στις απαιτούμενες ποσότητες.
Όταν ο ρόλος των γονιδίων είναι γνωστός και η σωστή λειτουργία τους μπορεί να εξασφαλιστεί μέσω της αντικατάστασης των ελαττωματικών γονιδίων, πολλές χρόνιες ασθένειες και ακόμη και καρκίνο μπορούν να επιτεθούν και να θεραπευτούν σε γενετικό επίπεδο χρησιμοποιώντας τεχνολογία ϋΝΑ.
Σχετικό περιεχόμενο: