Περιεχόμενο
Ποσοτικοποιήστε το δείγμα RNA σας μετρώντας την απορρόφηση του υπεριώδους φωτός (UV). Ένα φασματοφωτόμετρο νανο-σταγόνας θα χρησιμοποιεί μόνο ένα ή δύο μικρολίτρα του δείγματος σας, το οποίο μπορείτε να ανακτήσετε. Άλλα φασματοφωτόμετρα απαιτούν ένα πολύ μεγαλύτερο δείγμα. Ο συντελεστής απόσβεσης για νουκλεοτίδια σε μήκος κύματος υπεριωδών ακτίνων 260nm σε διαδρομή φωτός 1 cm είναι 20. Βάσει αυτού του συντελεστή απόσβεσης, η απορρόφηση των 40 μg / ml RNA υπό τις ίδιες συνθήκες είναι μία. Χρησιμοποιώντας αυτές τις πληροφορίες, μπορείτε να υπολογίσετε τη συγκέντρωση του δείγματος RNA σας.
Κάνετε μια αραίωση, εάν είναι απαραίτητο, του δείγματος σας. Μία τυποποιημένη αραίωση για μια μικροκυψέλη είναι 1:40. Κάνετε αυτήν την αραίωση προσθέτοντας 2μL δείγματος RNA σε 78μL αποστειρωμένου νερού.
Ακολουθήστε τα πρωτόκολλα του συγκεκριμένου φασματοφωτομέτρου για να βαθμονομήσετε το μηχάνημα χρησιμοποιώντας ένα τυφλό και στη συνέχεια να καθορίσετε την οπτική πυκνότητα του δείγματός σας σε μήκος κύματος UV 260nm.
Πολλαπλασιάστε την απορρόφηση του δείγματος σας με τον παράγοντα αραίωσης σας με 40 μg RNA / mL. Η εξίσωση θα είναι: "Συγκέντρωση RNA (μg / ml) = (OD260) x (συντελεστής αραίωσης) x (40μg RNA / ml) / (1 OD260 μονάδα)" (Hofstra.edu) 1:40 και η μέτρηση απορρόφησης ήταν 0,08, θα πολλαπλασιάσατε 0,08 x 40 x 40 = 128 μg / ml = 0,13 μg / μL
Καταγράψτε την καθαρότητα του δείγματός σας λαμβάνοντας μια άλλη ανάγνωση απορρόφησης σε μήκος κύματος UV 280nm. Ο λόγος OD 260 / OD 280 θα δείξει εάν - και σε ποιο επίπεδο - το δείγμα σας είναι μολυσμένο με πρωτεΐνη ή φαινόλη. Ένα αποτέλεσμα από 1,8 έως 2,0 υποδεικνύει ποιότητα RNA.