Περιεχόμενο
- Πλεονέκτημα: Ευαισθησία
- Πλεονέκτημα: Ειδικότητα
- Μειονέκτημα: Επιρρεπής σε ψευδή ή υποκειμενικά αποτελέσματα
- Μειονέκτημα: υψηλό κόστος και τεχνική ζήτηση
Το στύπωμα Western, μια αναλυτική τεχνική που χρησιμοποιείται για να εντοπίσει μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη σε ένα δεδομένο δείγμα, χρησιμοποιεί την ικανότητα ενός ενζύμου ή επισημασμένου με φθορισμό πρωτοταγούς αντισώματος να δεσμεύεται με το ειδικό αντιγόνο του. Πρόκειται για μια διαδικασία τριών σταδίων που ξεκινά με ηλεκτροφόρηση πηκτής, ακολουθούμενη από κηλίδα μεμβράνης και ανίχνευση με αντισώματα. Η ανίχνευση πρωτεϊνών μπορεί να είναι άμεση ή έμμεση, με την τελευταία να χρησιμοποιεί ένα επισημασμένο δευτερεύον αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι του πρωτεύοντος. Αν και γίνεται αποδεκτή ως τεχνική ρουτίνας ανάλυσης πρωτεϊνών, το Western blot έχει περιορισμούς καθώς και οφέλη.
Πλεονέκτημα: Ευαισθησία
Ένα από τα μεγαλύτερα επιχειρήματα υπέρ του western blot είναι η ευαισθησία του. Λόγω της ικανότητάς του να ανιχνεύει μόλις 0,1 νανογραμμάρια πρωτεΐνης σε ένα δείγμα, η τεχνική μπορεί θεωρητικά να χρησιμεύσει ως ένα αποτελεσματικό έγκαιρο διαγνωστικό εργαλείο, ανιχνεύοντας ακόμη και την παραμικρή ανοσογονική απόκριση από ιό ή βακτήρια σε δείγμα ασθενούς. Μια έμμεση κηλίδα Western βασίζεται περαιτέρω στην ευαισθησία αυτή από την ικανότητα του δευτερογενούς αντισώματος να ενισχύει την ένταση του σήματος που ανιχνεύεται από το σύστημα απεικόνισης. Μεγαλύτερη ευαισθησία σημαίνει ότι απαιτούνται λιγότερα αντισώματα για έλεγχο, γεγονός που μειώνει σημαντικά το εργαστηριακό κόστος.
Πλεονέκτημα: Ειδικότητα
Η τεχνική western blot οφείλει την ιδιαιτερότητά της σε δύο μεγάλους συντελεστές. Πρώτον, η ηλεκτροφόρηση πηκτής ταξινομεί ένα δείγμα σε πρωτεΐνες διαφορετικού μεγέθους, φορτίου και διαμόρφωσης. Αυτή η διαδικασία από μόνη της είναι ένα τεράστιο βήμα προς την ανίχνευση, καθώς οι ταινίες που σχηματίζονται στο πήκτωμα δίνουν ήδη ενδείξεις σχετικά με το μέγεθος της πρωτεΐνης ή του πολυπεπτιδίου που μας ενδιαφέρει. Η ειδικότητα της αλληλεπίδρασης αντισώματος-αντιγόνου χρησιμεύει ως ο δεύτερος μεγάλος παράγοντας. Επειδή τα συγκεκριμένα αντισώματα εμφανίζουν συγγένεια για συγκεκριμένες πρωτεΐνες, η διαδικασία μπορεί να ανιχνεύει επιλεκτικά μια πρωτεΐνη στόχο ακόμη και σε ένα μίγμα 300.000 διαφορετικών πρωτεϊνών.
Μειονέκτημα: Επιρρεπής σε ψευδή ή υποκειμενικά αποτελέσματα
Παρά την ευαισθησία και την ειδικότητά της, ένα στύπωμα δυτικού τύπου μπορεί ακόμα να παράγει εσφαλμένα αποτελέσματα. Ένα ψευδώς θετικό αποτέλεσμα όταν ένα αντίσωμα αντιδρά με μια μη προοριζόμενη πρωτεΐνη, κάτι που συμβαίνει συχνά όταν ένας ασθενής που ελέγχεται για τον HIV συμβαίνει να έχει φυματίωση ή μια σειρά παρασιτικών λοιμώξεων. Ένα ψευδώς αρνητικό, από την άλλη πλευρά, μπορεί εύκολα να προκύψει εάν δεν δοθεί επαρκής χρόνος στις μεγαλύτερες πρωτεΐνες για να μεταφερθεί σωστά στη μεμβράνη. Η ακατάλληλη στύπωση και επεξεργασία συχνά δημιουργούν λοξές, ξεθωριασμένες ή ακόμα και πολλαπλές ζώνες, με αποτέλεσμα τα αποτελέσματα των δοκιμών να υπόκεινται στην ερμηνεία του τεχνικού.
Μειονέκτημα: υψηλό κόστος και τεχνική ζήτηση
Το κόστος ενός στυπώματος western είναι ένα σύνθετο των μεγάλων μεμονωμένων δαπανών για τα αντισώματα με ετικέτα, τους ειδικευμένους αναλυτές και τον εργαστηριακό εξοπλισμό. Μια ευαίσθητη διαδικασία, το Western blotting απαιτεί ακρίβεια σε κάθε βήμα για την σωστή ταυτοποίηση των συστατικών του δείγματος. Ένα μικρό σφάλμα στη συγκέντρωση του αντιδραστηρίου ή στην περίοδο επώασης μπορεί να είναι καταστροφικό για όλη τη διαδικασία. Τέλος, ο εξοπλισμός που απαιτείται για ανίχνευση και απεικόνιση - συστήματα χημειοφωταύγειας, φθορισμού, ραδιενέργειας ή ανίχνευσης λέιζερ - μπορεί να είναι υπερβολικά ακριβός για τη μέση μονάδα μικροβιολογίας.