Περιεχόμενο
- Περιοριστικά ένζυμα και περιορισμοί
- Ο σωστός προσανατολισμός
- Η απομάκρυνση κολλώδους τελειώματος απαιτεί μικρότερο DNA
- Τα διαφορετικά ένζυμα μπορούν να δώσουν το ίδιο κολλώδες τέλος
Η μοριακή κλωνοποίηση είναι μια κοινή μέθοδος βιοτεχνολογίας που πρέπει να γνωρίζει κάθε μαθητής και ερευνητής. Μοριακή κλωνοποίηση με χρήση ενός τύπου ενζύμου που ονομάζεται ένζυμο περιορισμού για την αποκοπή ανθρώπινου DNA σε θραύσματα τα οποία στη συνέχεια μπορούν να εισαχθούν στο πλασμιδιακό DNA ενός βακτηριακού κυττάρου. Τα ένζυμα περιορισμού κόβουν το διπλόκλωνο DNA στα μισά. Ανάλογα με το ένζυμο περιορισμού, η κοπή μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα είτε ένα κολλώδες άκρο είτε ένα αμβλύ άκρο. Τα κολλώδη άκρα είναι πιο χρήσιμα στην μοριακή κλωνοποίηση επειδή εξασφαλίζουν ότι το θραύσμα ανθρώπινου DNA εισάγεται στο πλασμίδιο προς τη σωστή κατεύθυνση. Η διαδικασία σύνδεσης ή η σύντηξη θραυσμάτων DNA απαιτεί λιγότερα DNA όταν το DNA έχει κολλώδη άκρα. Τέλος, πολλαπλά ένζυμα περιορισμού κολλώδους άκρου μπορούν να παράγουν το ίδιο κολλώδες άκρο, παρόλο που κάθε ένζυμο αναγνωρίζει μια διαφορετική αλληλουχία περιορισμού. Αυτό αυξάνει την πιθανότητα να αποκοπεί η περιοχή DNA που σας ενδιαφέρει με ένζυμα κολλώδεις.
Περιοριστικά ένζυμα και περιορισμοί
Τα περιοριστικά ένζυμα είναι ένζυμα που κόβουν αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες σε δίκλωνο ϋΝΑ και κόβουν το ϋΝΑ κατά το ήμισυ σε αυτή την αλληλουχία. Η αναγνωρισμένη ακολουθία ονομάζεται περιοχή περιορισμού. Τα ένζυμα περιορισμού ονομάζονται ενδονουκλεάσες επειδή κόβουν το δίκλωνο DNA, το οποίο είναι ο τρόπος με τον οποίο υπάρχει κανονικά το DNA, σε θέσεις που βρίσκονται μεταξύ των άκρων του DNA. Υπάρχουν περισσότερα από 90 διαφορετικά ένζυμα περιορισμού. Κάθε μία αναγνωρίζει έναν ξεχωριστό χώρο περιορισμού. Τα ένζυμα περιορισμού διασπούν τις αντίστοιχες θέσεις περιορισμού τους 5.000 φορές πιο αποτελεσματικά από άλλες τοποθεσίες που δεν αναγνωρίζουν.
Ο σωστός προσανατολισμός
Τα ένζυμα περιορισμού έρχονται σε δύο γενικές κατηγορίες. Κόβουν είτε το DNA σε κολλώδη άκρα είτε σε αμβλύ άκρα. Ένα κολλώδες άκρο έχει μια σύντομη περιοχή νουκλεοτιδίων, τα δομικά στοιχεία του DNA, που είναι μη ζευγαρωμένα. Αυτή η μη ζευγαρωμένη περιοχή ονομάζεται προεξοχή. Η προεξοχή λέγεται ότι είναι κολλώδης επειδή θέλει και θα ζευχθεί με ένα άλλο κολλώδες άκρο που έχει συμπληρωματική αλληλουχία προεξοχών. Οι κολλώδεις άκρες είναι σαν τα μακρόστενα δίδυμα που προσπαθούν να αγκαλιάσουν ο ένας τον άλλον σφιχτά μόλις συναντηθούν. Από την άλλη πλευρά, τα αμβλύ άκρα δεν είναι κολλώδη επειδή όλα τα νουκλεοτίδια είναι ήδη συνδυασμένα μεταξύ των δύο κλώνων του DNA. Το πλεονέκτημα των κολλητικών άκρων είναι ότι ένα θραύσμα του ανθρώπινου DNA μπορεί να χωρέσει μόνο σε ένα βακτηριακό πλασμίδιο σε μία κατεύθυνση. Αντιθέτως, εάν και το ανθρώπινο ϋΝΑ και το βακτηριακό πλασμίδιο έχουν αμβλέα άκρα, το ανθρώπινο ϋΝΑ μπορεί να εισαχθεί στο πλασμίδιο από την κεφαλή προς την ουρά ή την ουρά-προς-κεφαλή.
Η απομάκρυνση κολλώδους τελειώματος απαιτεί μικρότερο DNA
Αν και το DNA με άκρα ραβδί έχει έναν ευκολότερο χρόνο να βρει ο ένας τον άλλον λόγω της "κολλώδους" του, ούτε κολλώδη άκρα ούτε αμβλύ άκρα μπορούν να συγχωνευθούν σε ένα συνεχές κομμάτι DNA. Ο σχηματισμός ενός συνεχούς τεμαχίου DNA που είναι εντελώς συνδεδεμένο απαιτεί ένα ένζυμο που ονομάζεται λιγάση. Οι λυγάσες συνδέουν τους σκελετούς των νουκλεοτιδίων στα κολλώδη ή αμβλύ άκρα, με αποτέλεσμα μια συνεχή αλυσίδα νουκλεοτιδίων. Επειδή τα κολλώδη άκρα βρίσκουν ο ένας τον άλλον γρηγορότερα λόγω της έλξης τους η μία στην άλλη, η διαδικασία της σύνδεσης απαιτεί λιγότερο ανθρώπινο ϋΝΑ και λιγότερο πλασμιδικό ϋΝΑ. Τα αμβλύ άκρα του DNA και των πλασμιδίων είναι λιγότερο πιθανό να βρεθούν μεταξύ τους και έτσι η απολίνωση των αμβλέων άκρων απαιτεί την τοποθέτηση περισσότερων DNA στο δοκιμαστικό σωλήνα.
Τα διαφορετικά ένζυμα μπορούν να δώσουν το ίδιο κολλώδες τέλος
Οι θέσεις περιορισμού εντοπίζονται σε όλο το γονιδίωμα των οργανισμών, αλλά δεν έχουν ομοιόμορφη απόσταση. Στα πλασμίδια, μπορούν να κατασκευαστούν ώστε να βρίσκονται ακριβώς δίπλα στον άλλο. Οι επιστήμονες που θέλουν να κόψουν ένα κομμάτι ανθρώπινου DNA από το ανθρώπινο γονιδίωμα πρέπει να βρουν θέσεις περιορισμού που βρίσκονται μπροστά και πίσω από την περιοχή του θραύσματος. Εκτός από την εξασφάλιση ότι ένα θραύσμα ϋΝΑ εισάγεται προς τη σωστή κατεύθυνση, διαφορετικά ένζυμα κολλώδους τελικού μπορούν να δημιουργήσουν το ίδιο κολλώδες άκρο ακόμα κι αν αναγνωρίζουν διαφορετικές αλληλουχίες περιορισμού. Για παράδειγμα, τα BamHI, BglII και Sau3A έχουν διαφορετικές αλληλουχίες αναγνώρισης αλλά παράγουν το ίδιο κολλώδες άκρο GATC. Αυτό αυξάνει την πιθανότητα ότι θα υπάρχουν κολλώδεις περιοχές περιορισμού τελών που φλερτάρουν το ανθρώπινο γονίδιο που σας ενδιαφέρει.