Περιεχόμενο
Το Western blotting είναι μία από τις πιο κοινές διαδικασίες στα βιοχημικά εργαστήρια. Βασικά, διαχωρίζει πρωτεΐνες από ένα δείγμα κατά μέγεθος, στη συνέχεια εξετάζει τη χρήση αντισωμάτων για να καθορίσει εάν υπάρχει μια δεδομένη πρωτεΐνη. Είναι χρήσιμο όχι μόνο στην έρευνα, αλλά και σε ιατρικά ή διαγνωστικά εργαστήρια. οι δοκιμές τόσο για HIV όσο και για τη νόσο Lyme, περιλαμβάνουν, για παράδειγμα, μια δοκιμασία ανοσοπροσροφητικής ανίχνευσης ενζύμου (ELISA), ακολουθούμενη από στύπωμα Western εάν η δοκιμασία ELISA είναι θετική. Παρά τη δημοτικότητά της, ωστόσο, το Western blotting έχει αρκετά μειονεκτήματα.
Μη ποσοτικά
Τα κλασικά κηλίδες Western δεν είναι ποσοτικά. Με άλλα λόγια, ενώ μπορούν να πει στους ερευνητές εάν υπάρχει μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη, δεν καθιστούν δυνατή την ποσοτικοποίηση της ποσότητας της πρωτεΐνης που υπάρχει. Ορισμένες εταιρείες βιοτεχνολογίας πωλούν τώρα εξαρτήματα που δίνουν τη δυνατότητα σε ερευνητές ή τεχνικούς εργαστηρίων να ποσοτικοποιήσουν την ποσότητα της πρωτεΐνης που υπάρχει χρησιμοποιώντας μια τυποποιημένη καμπύλη - αλλά αυτό λειτουργεί μόνο αν υπάρχουν διαθέσιμα καθαρά δείγματα της ίδιας πρωτεΐνης. Επιπλέον, το μοριακό βάρος μιας πρωτεΐνης μπορεί να εκτιμηθεί μόνο με στύπωμα Western, αντί να προσδιοριστεί με ακρίβεια όπως με τη φασματομετρία μάζας.
Αντισώματα
Ένα στύπωμα Western μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο εάν είναι διαθέσιμα πρωτογενή αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει. Ενώ αντισώματα για πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες είναι διαθέσιμα από εταιρείες βιοτεχνολογίας, δεν είναι φθηνά. εάν τα πρωτογενή αντισώματα δεν είναι διαθέσιμα για μια δεδομένη πρωτεΐνη, δεν θα είναι δυνατόν να εκτελεστεί μια κηλίδα Western που αναζητά αυτή τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Επιπλέον, οι ερευνητές μπορεί να θελήσουν να προσδιορίσουν εάν κάποια πρωτεΐνη έχει τροποποιηθεί με κάποιο τρόπο - εάν έχει φωσφορυλιωθεί (για παράδειγμα, είχε μια φωσφορική ομάδα συνδεδεμένη με αυτήν) - και με την τεχνική Western blot χρειάζονται αντισώματα ειδικά για το τροποποιημένο πρωτεΐνη.
Εκπαίδευση
Μπορεί να είναι δύσκολο να εκτελέσετε ένα Western blot σωστά και να έχετε καλά αποτελέσματα, έτσι ώστε το προσωπικό να είναι καλά εκπαιδευμένο.Σε αυτό, όπως και σε πολλά άλλα, η εμπειρία είναι ίσως ο καλύτερος δάσκαλος. ακόμα και για έναν έμπειρο τεχνικό, όμως, ένα στύπωμα Western χρονοβόρα. Το τμήμα ηλεκτροφόρησης πηκτώματος του πειράματος, για παράδειγμα, τυπικά θα διαρκέσει από μία έως δύο ώρες για να τρέξει. Άλλες εργασίες μπορούν να εκτελεστούν, ενώ η γέλη τρέχει, φυσικά, αλλά το πείραμα χρειάζεται ακόμα αρκετό χρόνο για να πάρει αποτελέσματα.
Άλλοι περιορισμοί
Τα αντισώματα ενδέχεται μερικές φορές να παρουσιάζουν κάποια σύνδεση εκτός στόχου, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε φτωχότερα αποτελέσματα. Επιπλέον, με το Western blotting, χρησιμοποιείτε ένα αντίσωμα έναντι μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης, έτσι τα αποτελέσματά σας θα σας ενημερώσουν μόνο εάν η πρωτεΐνη αυτή ήταν παρούσα. Η φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης, αντιθέτως, αποκαλύπτει όλες τις πρωτεΐνες που υπάρχουν σε ένα δείγμα και σε αντίθεση με την κλασική Western blotting είναι ποσοτική. Είναι σημαντικό να θυμόμαστε, φυσικά, ότι η φασματομετρία μάζας είναι πολύ πιο ακριβή και επίσης πιο τεχνικά δύσκολο να χρησιμοποιηθεί σε σύγκριση με το Western blotting.