Περιεχόμενο
- Γονιδιωματική και αλληλουχία DNA
- Ορισμός αλληλουχίας DNA
- DNA sequencing: Early Research
- Η μεγαλύτερη φιλοδοξία του Sanger ήταν η αλληλούχιση μεγάλων γενικών γονιδιωμάτων, αλλά η αλληλούχιση των ζευγαριών βάσεων των μικροσκοπικών βακτηριοφάγων, σε σύγκριση με την αλληλουχία των 3 δισεκατομμυρίων ζευγών βάσεων του ανθρώπινου γονιδιώματος. Παρόλα αυτά, η εκμάθηση της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος ενός βαριδιακού βακτηριοφάγου ήταν ένα σημαντικό βήμα προς τη συναρμολόγηση ολόκληρου του γονιδιώματος των ανθρώπων. Επειδή το DNA και τα χρωμοσώματα αποτελούνται από εκατομμύρια ζεύγη βάσεων, οι περισσότερες μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας διαχωρίζουν το DNA σε μικρούς κλώνους και τότε τα τμήματα του DNA είναι συναρμολογημένα μαζί. Απλά χρειάζεται χρόνο ή γρήγορα, εξελιγμένα μηχανήματα.
- Βασικά στοιχεία αλληλουχίας DNA
- Μέθοδοι αλληλουχίας DNA: Μέθοδοι Sanger
- Μια άλλη συναρπαστική εξέλιξη ήταν η μέθοδος κυνηγετικό όπλο που τυχαία δειγματοληψία και αλληλουχία έως και 700 ζεύγη βάσεων ταυτόχρονα. Ο Sanger είναι επίσης γνωστός για τη χρήση της μεθόδου διδεοξυ (διδεοξυνουκλεοτιδίου) που εισάγει νουκλεοτίδιο τερματισμού της αλυσίδας κατά τη διάρκεια της σύνθεσης DNA για να σημάνει τμήματα του DNA για ανάλυση. Τα διδεοξυνουκλεοτίδια διακόπτουν τη δραστικότητα ϋΝΑ πολυμεράσης και εμποδίζουν τη δημιουργία νουκλεοτιδίων σε μια σειρά DNA.
- Στάδια ακολουθίας DNA
- Προηγμένες τεχνολογίες DNA sequencing
- Το Πρόγραμμα Ανθρώπινου Γονιδιώματος
- Άλλα παραδείγματα αλληλουχίας DNA
- Δεοντολογικές επιπτώσεις της αλληλουχίας του DNA
Τα νουκλεοτίδια είναι τα χημικά δομικά στοιχεία της ζωής και βρίσκονται στο DNA των ζώντων οργανισμών. Κάθε νουκλεοτίδιο αποτελείται από μια ζάχαρη, φωσφορικό άλας και ένα βάση που περιέχει άζωτο: αδενίνη (Α), θυμίνη (Τ), κυτοσίνη (C) και γουανίνη (G). Η συγκεκριμένη σειρά αυτών των βάσεων νουκλεοτιδίων καθορίζει ποιες πρωτεΐνες, ένζυμα και μόρια θα συντεθούν από το κύτταρο.
Ο προσδιορισμός της σειράς ή της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων είναι σημαντικός για τη μελέτη των μεταλλάξεων, της εξέλιξης, της εξέλιξης της νόσου, των γενετικών εξετάσεων, της ιατροδικαστικής έρευνας και της ιατρικής.
Γονιδιωματική και αλληλουχία DNA
Γονιδιωματική είναι η μελέτη του DNA, των γονιδίων, των γονιδιακών αλληλεπιδράσεων και των περιβαλλοντικών επιδράσεων στα γονίδια. Το μυστικό για την εξάπλωση των πολύπλοκων εσωτερικών λειτουργιών των γονιδίων είναι η δυνατότητα να προσδιοριστεί η δομή και η θέση τους σε χρωμοσώματα.
Το μπλε των ζωντανών οργανισμών προσδιορίζεται από τη σειρά (ή αλληλουχία) ζευγών βάσης νουκλεϊκού οξέος στο DNA. Όταν το DNA αναδιπλασιάζεται, ζεύγη αδενίνης με θυμίνη και κυτοσίνη με γουανίνη. δεν λαμβάνονται υπόψη τα ζευγάρια μεταλλάξεις.
Δεδομένου ότι το μόριο δεσοξυριβονουκλεϊκού οξέος διπλής έλικας (DNA) σχεδιάστηκε το 1953, έγιναν δραματικές βελτιώσεις στον τομέα της γονιδιωματικής και της μεγάλης κλίμακας αλληλούχιση του DNA. Οι επιστήμονες εργάζονται με επιμέλεια για να εφαρμόσουν αυτή τη νέα γνώση στην εξατομικευμένη θεραπεία ασθενειών.
Ταυτόχρονα, οι συνεχιζόμενες συζητήσεις επιτρέπουν στους ερευνητές να παραμείνουν μπροστά στις ηθικές επιπτώσεις αυτών των τεχνολογιών που εκρήγνυνται ταχέως.
Ορισμός αλληλουχίας DNA
Η αλληλούχιση του DNA είναι η διαδικασία της ανακάλυψης της αλληλουχίας των διαφόρων βάσεων νουκλεοτιδίων στα αποσπάσματα του DNA. Η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδίου επιτρέπει συγκρίσεις χρωμοσωμάτων και γονιδιωμάτων που υπάρχουν στα ίδια και διαφορετικά είδη.
Η χαρτογράφηση των χρωμοσωμάτων είναι χρήσιμη για την επιστημονική έρευνα. Αναλύοντας τους μηχανισμούς και τη δομή των γονιδίων, των αλληλόμορφων και των χρωμοσωμικών μεταλλάξεων στα μόρια του DNA υποδηλώνει νέους τρόπους θεραπείας γενετικών διαταραχών και διακοπής της ανάπτυξης καρκινικών όγκων, για παράδειγμα.
DNA sequencing: Early Research
Οι μέθοδοι προσδιορισμού ακολουθίας DNA του Frederick Sanger προχώρησε σε μεγάλο βαθμό το πεδίο της γονιδιωματικής που ξεκίνησε τη δεκαετία του 1970. Ο Sanger αισθάνθηκε έτοιμος να αντιμετωπίσει την αλληλούχιση του DNA μετά την επιτυχή ανάλυση του RNA κατά την μελέτη της ινσουλίνης. Ο Σάνγκερ δεν ήταν ο πρώτος επιστήμονας που υποδύθηκε την αλληλούχιση του DNA. Ωστόσο, οι έξυπνες μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας του DNA - που αναπτύχθηκαν σε συνεργασία με τους συναδέλφους Berg και Gilbert - κέρδισαν το βραβείο Νόμπελ το 1980.
Η μεγαλύτερη φιλοδοξία του Sanger ήταν η αλληλούχιση μεγάλων γενικών γονιδιωμάτων, αλλά η αλληλούχιση των ζευγαριών βάσεων των μικροσκοπικών βακτηριοφάγων, σε σύγκριση με την αλληλουχία των 3 δισεκατομμυρίων ζευγών βάσεων του ανθρώπινου γονιδιώματος. Παρόλα αυτά, η εκμάθηση της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος ενός βαριδιακού βακτηριοφάγου ήταν ένα σημαντικό βήμα προς τη συναρμολόγηση ολόκληρου του γονιδιώματος των ανθρώπων. Επειδή το DNA και τα χρωμοσώματα αποτελούνται από εκατομμύρια ζεύγη βάσεων, οι περισσότερες μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας διαχωρίζουν το DNA σε μικρούς κλώνους και τότε τα τμήματα του DNA είναι συναρμολογημένα μαζί. Απλά χρειάζεται χρόνο ή γρήγορα, εξελιγμένα μηχανήματα.
Βασικά στοιχεία αλληλουχίας DNA
Ο Sanger γνώριζε την πιθανή αξία του έργου του και συχνά συνεργάστηκε με άλλους επιστήμονες που συμμερίστηκαν τα ενδιαφέροντά του στο DNA, τη μοριακή βιολογία και την επιστήμη της ζωής.
Αν και αργή και ακριβή σε σύγκριση με τις σημερινές τεχνολογίες αλληλούχισης, οι μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας του DNA του Sanger επαινούσαν εκείνη τη στιγμή. Μετά από δοκιμή και λάθος, ο Sanger βρήκε τη μυστική βιοχημική "συνταγή" για τον διαχωρισμό των κλώνων του DNA, δημιουργώντας περισσότερο DNA και αναγνωρίζοντας τη σειρά των νουκλεοτιδίων σε ένα γονιδίωμα.
Υλικά υψηλής ποιότητας μπορούν εύκολα να αγοραστούν για χρήση σε εργαστηριακές μελέτες:
Μέθοδοι αλληλουχίας DNA: Μέθοδοι Sanger
Ο Σανγκέρ βρήκε πώς να κόψει το DNA σε μικρά τμήματα χρησιμοποιώντας την πολυμεράση του ενζύμου ϋΝΑ.
Στη συνέχεια έκανε περισσότερα DNA από ένα πρότυπο και εισήγαγε ραδιενεργούς ιχνηθέτες στο νέο DNA για να οριοθετήσει τμήματα των διαχωρισμένων κλώνων. Αναγνώρισε επίσης ότι το ένζυμο χρειάζεται ένα αστάρι που θα μπορούσε να συνδεθεί με ένα συγκεκριμένο σημείο στο σκέλος του προτύπου. Το 1981, ο Σάνγκερ έκανε και πάλι ιστορικό, υπολογίζοντας το γονιδίωμα των 16.000 ζευγών βάσεων μιτοχονδριακού DNA.
Μια άλλη συναρπαστική εξέλιξη ήταν η μέθοδος κυνηγετικό όπλο που τυχαία δειγματοληψία και αλληλουχία έως και 700 ζεύγη βάσεων ταυτόχρονα. Ο Sanger είναι επίσης γνωστός για τη χρήση της μεθόδου διδεοξυ (διδεοξυνουκλεοτιδίου) που εισάγει νουκλεοτίδιο τερματισμού της αλυσίδας κατά τη διάρκεια της σύνθεσης DNA για να σημάνει τμήματα του DNA για ανάλυση. Τα διδεοξυνουκλεοτίδια διακόπτουν τη δραστικότητα ϋΝΑ πολυμεράσης και εμποδίζουν τη δημιουργία νουκλεοτιδίων σε μια σειρά DNA.
Στάδια ακολουθίας DNA
Η θερμοκρασία πρέπει να προσαρμόζεται προσεκτικά σε όλη τη διαδικασία προσδιορισμού της αλληλουχίας. Πρώτον, χημικά προστίθενται σε ένα σωλήνα και θερμαίνονται για να ξεδιπλωθούν (μετουσιώσουν) το δίκλωνο μόριο ϋΝΑ. Στη συνέχεια η θερμοκρασία ψύχεται, επιτρέποντας στο αστάρι να συνδεθεί.
Στη συνέχεια, η θερμοκρασία αυξάνεται για να ενθαρρυνθεί η βέλτιστη δράση πολυμεράσης DNA (ενζύμου).
Η πολυμεράση τυπικά χρησιμοποιεί τα διαθέσιμα κανονικά νουκλεοτίδια, τα οποία προστίθενται σε υψηλότερη συγκέντρωση.Όταν η πολυμεράση φτάσει σε νουκλεοτίδιο συνδεδεμένο με βαφή "αλυσίδας τερματισμού", η πολυμεράση σταματά και η αλυσίδα καταλήγει εκεί, πράγμα που εξηγεί γιατί τα βαμμένα νουκλεοτίδια καλούνται "τερματικά αλυσίδας" ή "τερματιστές".
Η διαδικασία συνεχίζεται πολλές, πολλές φορές. Τελικά, το συνδεδεμένο με βαφή νουκλεοτίδιο έχει τοποθετηθεί σε κάθε θέση της αλληλουχίας ϋΝΑ. Η ηλεκτροφόρηση πηκτής και τα προγράμματα ηλεκτρονικών υπολογιστών μπορούν στη συνέχεια να ταυτοποιήσουν τα χρώματα χρωστικής σε κάθε έναν από τους κλώνους DNA και να καταλάβουν ολόκληρη την αλληλουχία του DNA με βάση τη βαφή, τη θέση της βαφής και το μήκος των κλώνων.
Προηγμένες τεχνολογίες DNA sequencing
Υψηλής απόδοσης αλληλουχία - γενικά αναφέρεται ως ακολουθία επόμενης γενιάς - χρησιμοποιεί νέες εξελίξεις και τεχνολογίες για την αλληλουχία νουκλεοτιδικών βάσεων πιο γρήγορα και φθηνότερα από ποτέ. Μια μηχανή προσδιορισμού αλληλουχίας DNA μπορεί εύκολα να χειριστεί μεγάλες εκτάσεις DNA. Στην πραγματικότητα, ολόκληρα τα γονιδιώματα μπορούν να γίνουν σε λίγες ώρες, αντί για χρόνια με τις τεχνικές αλληλουχίας του Sanger.
Οι μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας επόμενης γενιάς μπορούν να χειριστούν ανάλυση όγκου ϋΝΑ μεγάλου όγκου χωρίς το πρόσθετο στάδιο ενίσχυσης ή κλωνοποίησης για να πάρει αρκετό ϋΝΑ για αλληλούχιση. Οι μηχανές προσδιορισμού ακολουθίας DNA εκτελούν πολλαπλές αντιδράσεις αλληλουχίας σε μια στιγμή, η οποία είναι φθηνότερη και ταχύτερη.
Ουσιαστικά, η νέα τεχνολογία προσδιορισμού αλληλουχίας DNA εκτελεί εκατοντάδες αντιδράσεις Sanger σε ένα μικρό, εύκολα αναγνώσιμο μικροτσίπ που στη συνέχεια τρέχει μέσω ενός προγράμματος υπολογιστή που συναρμολογεί την ακολουθία.
Η τεχνική διαβάζει βραχύτερα θραύσματα DNA, αλλά είναι ακόμα ταχύτερη και αποτελεσματικότερη από τις μεθόδους αλληλούχισης του Sanger, έτσι ώστε να μπορούν να ολοκληρωθούν γρήγορα έργα μεγάλης κλίμακας.
Το Πρόγραμμα Ανθρώπινου Γονιδιώματος
ο Πρόγραμμα ανθρώπινου γονιδιώματος, που ολοκληρώθηκε το 2003, είναι μία από τις πιο γνωστές μελέτες αλληλουχίας που έχουν γίνει μέχρι σήμερα. Σύμφωνα με το 2018 άρθρο στο Επιστήμη Νέα, το ανθρώπινο γονιδίωμα αποτελείται περίπου 46,831 γονίδια, η οποία ήταν μια τεράστια πρόκληση για την αλληλουχία. Οι κορυφαίοι επιστήμονες από όλο τον κόσμο πέρασαν σχεδόν 10 χρόνια συνεργασίας και διαβούλευσης. Με επικεφαλής την Εθνική Έρευνα Ανθρώπινου Γονιδιώματος
Ινστιτούτο, το σχέδιο χαρτογράφησε επιτυχώς το ανθρώπινο γονιδίωμα χρησιμοποιώντας ένα σύνθετο δείγμα που ελήφθη από ανώνυμους δότες αίματος.
Το Πρόγραμμα Ανθρώπινου Γονιδιώματος στηρίχθηκε σε μεθόδους αλληλούχησης βακτηριακών τεχνητών χρωμοσωμάτων (με βάση το BAC) για χαρτογράφηση ζευγών βάσεων. Η τεχνική χρησιμοποίησε βακτηρίδια για την κλωνοποίηση θραυσμάτων DNA, με αποτέλεσμα μεγάλες ποσότητες DNA για αλληλούχιση. Οι κλώνοι στη συνέχεια μειώθηκαν σε μέγεθος, τοποθετήθηκαν σε μια μηχανή προσδιορισμού αλληλουχίας και συναρμολογήθηκαν σε εκτάσεις που αντιπροσωπεύουν ανθρώπινο ϋΝΑ.
Άλλα παραδείγματα αλληλουχίας DNA
Νέες ανακαλύψεις στη γονιδιωματική είναι βαθιά μεταβαλλόμενες προσεγγίσεις για την πρόληψη, ανίχνευση και θεραπεία των ασθενειών. Η κυβέρνηση έχει δεσμεύσει δισεκατομμύρια δολάρια για έρευνα DNA. Η επιβολή του νόμου στηρίζεται στην ανάλυση DNA για την επίλυση υποθέσεων. Τα κιτ δοκιμών DNA μπορούν να αγοραστούν για οικιακή χρήση για την έρευνα των προγόνων και να εντοπιστούν οι γονιδιακές παραλλαγές που μπορεί να θέσουν σε κίνδυνο την υγεία:
Δεοντολογικές επιπτώσεις της αλληλουχίας του DNA
Οι νέες τεχνολογίες συχνά έρχονται με τη δυνατότητα κοινωνικού οφέλους, καθώς και βλάβης. παραδείγματα περιλαμβάνουν τη δυσλειτουργία πυρηνικών σταθμών και πυρηνικών όπλων μαζικής καταστροφής. Οι τεχνολογίες DNA έρχονται και με τους κινδύνους.
Οι συναισθηματικές ανησυχίες σχετικά με την αλληλούχιση του DNA και τα εργαλεία επεξεργασίας γονιδίων όπως το CRISPR περιλαμβάνουν φόβους ότι η τεχνολογία θα μπορούσε να διευκολύνει την ανθρώπινη κλωνοποίηση ή να οδηγήσει σε μεταλλαγμένα διαγονιδιακά ζώα που δημιουργήθηκαν από έναν αδίστακτο επιστήμονα.
Πιο συχνά, τα ηθικά ζητήματα που σχετίζονται με την αλληλούχιση του DNA έχουν να κάνουν με την ενημερωμένη συναίνεση. Η εύκολη πρόσβαση στη δοκιμή DNA απευθείας από τον καταναλωτή σημαίνει ότι οι καταναλωτές ενδέχεται να μην κατανοούν πλήρως πώς θα χρησιμοποιηθούν, θα αποθηκευτούν και θα μοιραστούν οι γενετικές τους πληροφορίες. Οι άνθρωποι μπορούν να μην είναι συναισθηματικά έτοιμοι να μάθουν για τις ελαττωματικές γονιδιακές τους παραλλαγές και τους κινδύνους για την υγεία.
Τρίτα μέρη όπως οι εργοδότες και οι ασφαλιστικές εταιρείες θα μπορούσαν ενδεχομένως να κάνουν διακρίσεις σε βάρος ατόμων που φέρουν ελαττωματικά γονίδια που μπορεί να προκαλέσουν σοβαρά ιατρικά προβλήματα.