Περιεχόμενο
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής είναι μια τεχνική που επιτρέπει στο DNA να αναλυθεί στο επίπεδο των συστατικών μορίων του. Σε αυτή τη μέθοδο απεικόνισης DNA, τα δείγματα τοποθετούνται σε μέσο πηκτής αγαρόζης και ένα ηλεκτρικό πεδίο εφαρμόζεται στο πήκτωμα. Αυτό προκαλεί τη μετανάστευση θραυσμάτων DNA μέσω του πηκτώματος με διαφορετικούς ρυθμούς σύμφωνα με τις ηλεκτροχημικές ιδιότητές τους.
Βρωμιούχο αιθίδιο
Για αυτή την τεχνική απεικόνισης, βρωμιούχο αιθίδιο αναμιγνύεται με σκόνη αγαρόζης, ρυθμιστικό διάλυμα ΕϋΤΑ και νερό για να σχηματιστεί η μήτρα πηκτής πριν την ηλεκτροφόρηση. Ως αποτέλεσμα, τα μόρια βρωμιούχου αιθιδίου διασκορπίζονται ομοιόμορφα σε όλη την μήτρα. Μόλις τα πηγάδια πηκτωμάτων γεμιστούν με τα αντίστοιχα δείγματα DNA τους και τις βαφές παρακολούθησης, εφαρμόζεται τάση για να τραβούν αργά οι μεγάλες, πολικές ενώσεις σε όλη την μήτρα.
Κατά τη διάρκεια αυτής της κίνησης, οι βάσεις των μορίων ϋΝΑ δεσμεύονται προσωρινά στα σωματίδια χάρη στο φορτίο του βρωμιούχου αιθιδίου, που τα σέρνει μαζί. Μέχρι τη στιγμή που η ηλεκτροφόρηση πηκτής είναι πλήρης, κάθε μόριο ϋΝΑ έχει συλλεχθεί σε σημαντική ποσότητα βρωμιούχου αιθιδίου.
Υπό την παρουσία υπεριώδους φωτός, το βρωμιούχο αιθίδιο παρουσιάζει φθορισμό. Οι τεχνικοί φωτίζουν ένα ειδικά βαθμονομημένο υπεριώδες φως στο πέλμα ενώ μια μηχανή συλλαμβάνει την εικόνα των λαμπερών θραυσμάτων.
Μεθυλενο μπλε
Εάν δεν υπάρχει διαθέσιμος ή πρακτικός διαυγαστήρας υπεριωδών ακτίνων, οι τεχνικοί μπορούν να καταστήσουν το ΟΝΑ ορατό υπό κανονικές συνθήκες με εμβάπτιση της τελικής πηκτής αγαρόζης με ηλεκτροφορημένο DNA μέσα σε ένα διάλυμα κυανού του μεθυλενίου όλη τη νύκτα.
Ένα χλωριούχο άλας με ένα σημαντικά υδρόφοβο ανιόν, μόρια μπλε του μεθυλενίου διεισδύουν σε ολόκληρη τη μήτρα πηκτής. Ωστόσο, η δέσμευση υδρογόνου καθ 'όλη τη διάρκεια του DNA προκαλεί τη συσσώρευση των μορίων λεκέδων. Αυτή η αυξημένη πυκνότητα χρώματος DNA αποδίδει μια βαθύτερη απόχρωση του μπλε, ορατή με γυμνό μάτι.
Βαφές παρακολούθησης
Πέρα από το σχετικό μέγεθος των ταινιών DNA, οι τεχνικοί μπορούν να μετρήσουν το απόλυτο μέγεθος (σε ζεύγη βάσεων) κάθε θραύσματος χρησιμοποιώντας χημικές ουσίες που ονομάζονται βαφές παρακολούθησης. Ορατοί χωρίς την προσθήκη κυανιούχου μεθυλενίου ή βρωμιούχου αιθιδίου, βαφές παρακολούθησης όπως κυανό βρωμοφαινόλης και κυανόξυ ξυλενίου κινούνται κατά μήκος των πλεγμάτων πηκτής αραβοζης κατά την ηλεκτροφόρηση με την ίδια ταχύτητα όπως τα θραύσματα ϋΝΑ που αποτελούνται από 300 νουκλεοτίδια και 4.000 νουκλεοτίδια αντίστοιχα. Στην ηλεκτροφόρηση, πιο ογκώδη θραύσματα DNA περνούν κατά μήκος της μήτρας πηκτής με μικρότερη ταχύτητα από τα μικρότερα θραύσματα. Επομένως, ενώ οι βαφές παρακολούθησης δεν επηρεάζουν άμεσα την ορατότητα των θραυσμάτων DNA, η σύγκριση της θέσης ενός θραύσματος ϋΝΑ στο πήκτωμα με τη θέση αυτών των βαφών επιτρέπει στους τεχνικούς να "δουν" τον κατά προσέγγιση αριθμό νουκλεοτιδίων που περιέχει το θραύσμα ϋΝΑ.