Περιεχόμενο
- Τι είναι ηλεκτροφόρηση πηκτώματος;
- Συστατικά της ηλεκτροφόρησης
- Μορφοποίηση του πηκτώματος
- Πώς λειτουργεί η ηλεκτροφόρηση;
- Φόρτιση και μέγεθος Προσδιορισμός των ζωνών DNA
- Εφαρμογές και χρήσεις ηλεκτροφόρησης
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής, που συχνά ονομάζεται επίσης ηλεκτροφόρηση DNA ή απλά ηλεκτροφόρηση, είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για να διαχωρίσει θραύσματα DNA (και άλλα φορτισμένα μόρια) ανάλογα με το μέγεθος. Αυτό τυπικά γίνεται χρησιμοποιώντας γέλη αγαρόζης και ηλεκτρικό φορτίο για να διαχωριστούν θραύσματα μεταξύ τους.
Αυτή η τεχνική έχει μερικές εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένης της εξέτασης DNA, DNA fingering, εγκληματολογία και διάφορες ιατρικές εφαρμογές επίσης.
Τι είναι ηλεκτροφόρηση πηκτώματος;
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής είναι μια τεχνική που επιτρέπει στους επιστήμονες να διαχωρίζουν φορτισμένα μόρια ανάλογα με το μέγεθος. Αυτό περιλαμβάνει DNA, RNA και πρωτεΐνες.
Θυμηθείτε, το DNA και το RNA έχουν ένα ελαφρώς αρνητικό φορτίο χάρη στα αρνητικά φορτισμένα μόρια οξυγόνου στη ραχοκοκκαλιά σακχάρου-φωσφορικού του μορίου. Οι πρωτεΐνες μπορούν να έχουν ένα εύρος φορτίων ανάλογα με τα αμινοξέα μέσα στην πολυπεπτιδική αλυσίδα.
Συστατικά της ηλεκτροφόρησης
Για να εκτελεστεί ηλεκτροφόρηση, πρώτα πρέπει να γίνει η πηκτή. Αυτό μπορεί να γίνει σχεδόν σε οποιοδήποτε εργαστήριο. τα πηκτώματα αγαρόζης είναι τα πιο κοινά. Για να γίνει το πήκτωμα, η σκόνη αγαρόζης αναμιγνύεται με ένα ειδικό ρυθμιστικό που ονομάζεται ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης. Αυτό το μίγμα στη συνέχεια θερμαίνεται μέχρι να διαλυθεί η αγαρόζη και να αναμιχθεί πλήρως στο ρυθμιστικό διάλυμα.
Σημειώστε ότι μερικά πρωτόκολλα ηλεκτροφόρησης απαιτούν την προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου (Et-Br). Αυτό κηλιδώνει οποιοδήποτε DNA που χρησιμοποιείται στην ηλεκτροφόρηση για να μπορείτε να δείτε τη θέση των θραυσμάτων κάτω από το υπεριώδες φως.
Μορφοποίηση του πηκτώματος
Αυτό στη συνέχεια χύνεται σε ένα ορθογώνιο καλούπι που ονομάζεται δίσκος χύτευσης πηκτής. Μαζί με το καλούπι που δημιουργεί το ορθογώνιο πήκτωμα που χρησιμοποιείται για ηλεκτροφόρηση, μια χτένα τοποθετείται σε ένα από τα άκρα της γέλης. Αυτή η χτένα κάνει τα πηγάδια όπου φορτώνονται τα δείγματα που θέλετε να διαχωρίσετε μέσω ηλεκτροφόρησης. Μπορείτε να δείτε μια φωτογραφία εδώ.
Μόλις σκληρυνθεί το πήκτωμα, αφαιρείται η χτένα και το πήκτωμα τοποθετείται σε ειδική δεξαμενή ηλεκτροφόρησης. Ένα άλλο ρυθμιστικό διάλυμα γεμίζεται στη δεξαμενή μέχρις ότου ένα ελαφρύ στρώμα ρυθμιστικού διαλύματος καλύψει πλήρως τη γέλη αγαρόζης.
Αυτή η δεξαμενή παράγει ένα ηλεκτρικό ρεύμα (που κυμαίνεται από 50 έως 150 V) μέσω του ρυθμιστικού διαλύματος και, με τη σειρά του, μέσω της γέλης αγαρόζης. Τα φρεάτια της γέλης αγαρόζης τοποθετούνται στο αρνητικό άκρο του ρεύματος (το κάθοδος) με το άλλο άκρο της γέλης στο θετικό άκρο του ρεύματος (το άνοδος).
Πώς λειτουργεί η ηλεκτροφόρηση;
Πριν το ηλεκτρικό ρεύμα τρέξει μέσα από τη δεξαμενή και το πήκτωμα, τα δείγματα σας φορτώνονται στα φρεάτια. Αυτό γίνεται χρησιμοποιώντας μια μικροπιπέτα. Ένα δείγμα "δείκτη", επίσης γνωστό ως σκάλα DNA, είναι ένα δείγμα με γνωστά μεγέθη θραυσμάτων DNA που μπορούν να σας βοηθήσουν να συγκρίνετε τα δείγματα σας και να κατανοήσετε τα μεγέθη του δείγματος που δοκιμάζετε.
Συχνά, α βαφή παρακολούθησης (που ονομάζεται επίσης βαφή φόρτωσης) προστίθεται σε κάθε δείγμα για να σας βοηθήσει να τοποθετήσετε το δείγμα στα φρεάτια. Η βαφή σας βοηθά επίσης να παρακολουθείτε την κίνηση των δειγμάτων μέσω του πηκτώματος.
Πώς λοιπόν τα δείγματα μετακινούνται πραγματικά μέσω του πηκτώματος και διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθος; Έχει σχέση με το ηλεκτρικό ρεύμα που διέρχεται από το πήκτωμα αγαρόζης μαζί με το μέγεθος / δομή των θραυσμάτων και πήκτωμα αγαρόζης.
Φόρτιση και μέγεθος Προσδιορισμός των ζωνών DNA
Θυμηθείτε ότι συνολικά, η επιβάρυνση DNA είναι αρνητικός . Έτσι, όταν αυτά τα δείγματα τοποθετούνται σε φρεάτια που βρίσκονται κοντά στο αρνητικό άκρο του ηλεκτρικού ρεύματος, αυτό θα προκαλέσει την κίνηση του αρνητικά φορτισμένου DNA μακριά από την κάθοδο (αρνητική φόρτιση) και μετακίνηση προς την άνοδο (θετικό φορτίο) στο αντίθετο άκρο.
Εκτός από αυτή την κίνηση των δειγμάτων, η ηλεκτροφόρηση διαχωρίζει επίσης τα δείγματα και τα θραύσματα σε αυτά τα δείγματα κατά μέγεθος. Αυτό είναι επειδή μικρότερα μόρια και θραύσματα μπορεί Κουνήσου γρηγορότερα και πιο εύκολα μέσω του πηκτώματος ενώ μεγαλύτερα μόρια και θραύσματα κινούνται πιο αργά. Αυτό σημαίνει ότι μικρά θραύσματα θα κινούνται στο άκρο της γέλης πιο γρήγορα από τα μεγαλύτερα και ως εκ τούτου διαχωρίζουν κάθε θραύσμα κατά μέγεθος.
Αφού η γέλη τρέξει για περίπου μία ώρα (στα περισσότερα πρωτόκολλα), το φορτίο σβήνει και αναλύεται η γέλη. Θα δείτε μια ξεχωριστή ορθογώνια ζώνη, που συχνά ονομάζεται ζώνη DNA ή ζώνη πρωτεϊνών, σε διάφορα σημεία κατά μήκος της γέλης. Κάθε ζώνη αντιπροσωπεύει ένα θραύσμα που έχει μετακινηθεί κατά μήκος της γέλης.
Εφαρμογές και χρήσεις ηλεκτροφόρησης
Υπάρχουν πολλές εφαρμογές για ηλεκτροφόρηση στο εργαστήριο. Εδώ είναι μερικά μόνο: