Περιεχόμενο
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, ή η PCR, είναι μια τεχνική που φωτοτυπώνει ένα κομμάτι του DNA σε πολλά θραύσματα - εκθετικά πολλά. Το πρώτο βήμα είναι η PCR είναι η θέρμανση του DNA έτσι ώστε να μετουσιώνεται ή να λιώσει σε μονές έλικες. Η δομή του DNA είναι σαν μια σκάλα σχοινιού στην οποία τα σκαλοπάτια είναι σχοινιά με μαγνητικά άκρα. Οι μαγνήτες συνδέονται για να σχηματίσουν τα σκαλοπάτια, που ονομάζονται ζεύγη βάσεων, και έτσι αντιστέκονται στην αποσύνδεση. Κάθε θραύσμα του DNA τήκεται σε μονές αλυσίδες σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο συγκρατείται η δομή του DNA από τα μεμονωμένα μέρη του DNA θα δώσει μια εικόνα για το λόγο ότι τα διαφορετικά θραύσματα DNA λιώνουν σε διαφορετικές θερμοκρασίες και γιατί χρειάζονται τέτοιες υψηλές θερμοκρασίες.
Τήξη! Τήξη!
Το πρώτο στάδιο της PCR είναι η τήξη του DNA έτσι ώστε το δίκλωνο DNA να διαχωρίζεται σε μονόκλωνο DNA. Για το DNA θηλαστικών, αυτό το πρώτο στάδιο συνήθως περιλαμβάνει θερμότητα περίπου 95 βαθμών Celcius (περίπου 200 βαθμούς Fahrenheit). Σε αυτή τη θερμοκρασία οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των ζευγών βάσης Α-Τ και G-C, ή σκαλοπατιών στη σκάλα ϋΝΑ, θραύονται, αποσυνδέοντας το δίκλωνο DNA. Ωστόσο, η θερμοκρασία δεν είναι αρκετά ζεστή ώστε να σπάσει τη ραχοκοκαλιά φωσφορικού σακχάρου που σχηματίζει τις μονές έλικες ή τους πόλους της σκάλας. Ο πλήρης διαχωρισμός των μονών κλώνων τα προετοιμάζει για το δεύτερο στάδιο της PCR, το οποίο ψύχεται για να επιτρέψει σύντομα θραύσματα DNA, που ονομάζονται πριμοδότες, να δεσμεύσουν τις μονές αλυσίδες.
Μαγνητικά φερμουάρ
Ένας λόγος που το DNA θερμαίνεται στην υψηλή θερμοκρασία των 95 βαθμών Celcius είναι ότι όσο περισσότερο είναι το διπλό σκέλος DNA, τόσο περισσότερο θέλει να μείνει μαζί. Το μήκος του DNA είναι ένας παράγοντας που επηρεάζει το σημείο τήξης που επιλέχθηκε για PCR σε αυτό το κομμάτι DNA. Τα ζεύγη βάσεων Α-Τ και Ο-Ο στον διπλόκλωνο δεσμό DNA μεταξύ τους για να συγκρατήσουν μαζί τη δομή των δύο κλώνων. Τα πιο διαδοχικά ζεύγη βάσεων μεταξύ δύο μονόκλωνων συνδέονται, τόσο περισσότερο οι γείτονές τους θέλουν επίσης να δεσμεύσουν, και τόσο ισχυρότερη γίνεται η έλξη μεταξύ των δύο κλώνων. Είναι σαν φερμουάρ κατασκευασμένο από μικρούς μαγνήτες. Καθώς κλείνετε το φερμουάρ, οι μαγνήτες θα θελήσουν φυσικά να κλείσουν και να παραμείνουν φερμουάρ.
Ισχυρότεροι μαγνήτες κολλήστε πιο σφιχτά
Ένας άλλος παράγοντας που επηρεάζει τη θερμοκρασία τήξης που επιλέγεται για το θραύσμα DNA που μας ενδιαφέρει είναι η ποσότητα των ζευγών βάσεων G-C που υπάρχουν σε αυτό το θραύσμα. Κάθε ζεύγος βάσεων είναι σαν δύο μικρο-μαγνήτες που προσελκύουν. Ένα ζευγάρι που αποτελείται από G και C προσελκύεται πολύ περισσότερο από ένα ζεύγος Α και Τ. Έτσι, ένα κομμάτι DNA που έχει περισσότερα ζεύγη G-C από ένα άλλο θραύσμα θα απαιτήσει υψηλότερη θερμοκρασία πριν λιώσει σε μονές αλυσίδες. Το DNA απορροφά φυσικά το υπεριώδες φως - στο μήκος κύματος 260 νανόμετρα, για να είναι ακριβές - και το μονόκλωνο DNA απορροφά περισσότερο φως από το δίκλωνο DNA. Επομένως, η μέτρηση της απορροφούμενης ποσότητας φωτός είναι ένας τρόπος μέτρησης του ποσοστού του διπλού κλώνου DNA σας που έχει λιώσει σε μονές δέσμες. Το φαινόμενο "μαγνητικού φερμουάρ" των ζευγών βάσεων G-C και Α-Τ είναι αυτό που προκαλεί μια γραφική παράσταση της απορρόφησης φωτός του διπλής έλικος DNA σχεδιασμένη κατά της αύξησης της θερμοκρασίας για να είναι σιγμοειδής, διαμορφωμένη σαν S και όχι ευθεία γραμμή. Η καμπύλη του S αντιπροσωπεύει την αντίσταση ομαδικής εργασίας που τα ζεύγη βάσεων ασκούν ενάντια στη θερμότητα επειδή δεν θέλουν να χωριστούν.
Το μισό σημείο
Η θερμοκρασία στην οποία ένα μήκος ϋΝΑ τήκεται σε μονές αλυσίδες ονομάζεται θερμοκρασία τήξης της, η οποία υποδηλώνεται με τη συντομογραφία "Tm." Αυτό δείχνει τη θερμοκρασία στην οποία το ήμισυ του DNA σε ένα διάλυμα έχει λιώσει σε μονές έλικες και το άλλο μισό είναι ακόμη σε μορφή διπλής έλικας. Η θερμοκρασία τήξης είναι διαφορετική για κάθε θραύσμα του DNA. Το DNA θηλαστικών έχει περιεκτικότητα G-C 40%, δηλαδή το υπόλοιπο 60% των ζευγών βάσης είναι As και Ts. Η περιεκτικότητά του σε 40% G-C προκαλεί την τήξη των DNA των θηλαστικών στους 87 βαθμούς Κελσίου (περίπου 189 βαθμούς Κελσίου). Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο το πρώτο βήμα της PCR στο DNA των θηλαστικών είναι να ζεσταθεί σε 94 βαθμούς Celcius (201 Fahrenheit). Μόλις επτά βαθμούς πιο ζεστό από τη θερμοκρασία τήξης και όλες οι διπλές έλικες θα λιώσει τελείως σε μονές δέσμες.