Περιεχόμενο
Το γενετικό μπλε ενός κυττάρου κωδικοποιείται στο γενετικό του υλικό ή στο DNA. Δεδομένου ότι το DNA δεν εγκαταλείπει ποτέ τον πυρήνα του κυττάρου, προκειμένου να μεταφερθεί αυτή η πληροφορία στο κυτταρόπλασμα όπου υπάρχουν άλλες πρωτεΐνες και βιοχημικά συστατικά, είναι απαραίτητο να μεταγραφεί πρώτα το DNA σε αγγελιοφόρο RNA (mRNA ή πολυ (Α) RNA). Αυτό το mRNA στη συνέχεια μεταφράζεται σε πρωτεΐνες που εκτελούν πολλές λειτουργίες του κυττάρου. Για να ανιχνεύσουμε ή να ποσοτικοποιήσουμε πολύ σπάνια mRNAs, να κατασκευάσουμε ανιχνευτές μικροσυστοιχιών ή να κατασκευάσουμε βιβλιοθήκες συμπληρωματικών μορίων ϋΝΑ, πρέπει να απομονωθεί mRNA. Ωστόσο, η ολική RNA (δηλ. Όλη η RNA σε μια κυτταρική) εξαγωγή και η επακόλουθη απομόνωση του mRNA δεν είναι αλληλοαποκλειόμενες διεργασίες. το πρώτο πρέπει να εκτελείται προκειμένου να εξάγεται το mRNA.
Απομόνωση mRNA Από συνολικό RNA
Ομογενοποίηση TRIzol: Το ολικό RNA περιλαμβάνει όλα τα mRNA, το RNA μεταφοράς, το ριβοσωμικό RNA και άλλα μη κωδικοποιημένα RNAs. Για να διαχωριστούν αυτά από άλλα κυτταρικά συστατικά, το κύτταρο αρχικά ανοίγει για να απελευθερώσει το περιεχόμενό του. Αυτό γίνεται με επαναιώρηση κυττάρων που σχηματίζουν σφαιρίδια με φυγοκέντρηση (κλώση σε υψηλές ταχύτητες) σε αντιδραστήριο TRIzol (Life Technologies). Άλλες εκδόσεις του TRIzol (όπως το αντιδραστήριο TRI του Ambion) λειτουργούν ομοίως.
Ολική απομόνωση RNA: Χρησιμοποιείται μια σειρά φυγοκέντρησης για τον διαχωρισμό των διαφορετικών συστατικών (πρωτεΐνες, ϋΝΑ, RNA) του κυττάρου σε στρώματα ή φάσεις εντός του εναιωρήματος. Η κορυφαία κίτρινη φάση αποτελείται από λίπος και μπορεί να απορριφθεί. Η επιθυμητή φάση είναι χρωματισμένη κόκκινη, περιέχει το συνολικό RNA και διατηρείται. Μετά την πραγματοποίηση εκχύλισης με φαινόλη-χλωροφόρμιο και μιας σειράς πλύσεων αλκοόλης χρησιμοποιώντας ισοπροπανόλη και αιθανόλη, το RNA μπορεί να σφαιροποιηθεί για απομόνωση mRNA. Προσθέστε αναστολείς ΚΝάσης για να αποτρέψετε αυτό το ένζυμο από την αποικοδόμηση του ολικού RNA.
Εκχύλιση mRNA: Είναι συνηθισμένο να χρησιμοποιείται ένα κιτ για την απομόνωση των mRNAs, καθώς τα εργαστηριακά πρωτόκολλα εργαστηρίου δεν παράγουν μεγάλες ποσότητες υψηλής καθαρότητας mRNAs. Τα εμπορικά πακέτα περιλαμβάνουν το κιτ απομόνωσης του FastTrack 2.0 της Invitrogen ή το πολυ (Α) καθαρό mRNA απομόνωσης του Ambion. Αυτά τα βασικά βήματα είναι κοινά σε αυτά τα κιτ:
α) Αναμείξτε το ανασταλμένο με ΚΝάση ρυθμιστικό λύσης που παρέχεται στο κιτ με μέχρι 300 μικρολίτρα συνολικού RNA.
β) Θερμάνετε για 5 λεπτά στους 65 βαθμούς Κελσίου και κατόπιν ψύξτε αμέσως το δείγμα στον πάγο για ένα λεπτό.
γ) Αναμίξτε το με χλωριούχο νάτριο 0,5Μ και στη συνέχεια διαλύστε πλήρως το ολιγο-dT (ολιγοδεοξυθυμιδυλικό οξύ) σε αυτό το δείγμα.
δ) Φυγοκεντρίστε αυτό το δείγμα και ανακτήστε το υπερκείμενο, το οποίο πλένεται αρκετές φορές σε μια σειρά ρυθμιστικών δεσμεύσεων και χαμηλού άλατος που παρέχονται στα κιτ.
ε) Εκλούστε το mRNA αρκετές φορές μέχρις ότου αποκτηθεί ένας καθορισμένος όγκος (π.χ. 500 μικρολίτρα).
στ) Καθίζετε το έκλουσμα με καθίζηση οξικού νατρίου και αιθανόλης. Επανασυνδέεται σε μέχρι 20 μικρολίτρα νερού επεξεργασμένου με διαιθυλοπυροανθρακικό (DEPC).
ζ) Αποθηκεύεται στους -80 βαθμούς Κελσίου και ελέγχεται για ποιότητα και ποσότητα με φασματοφωτομετρία.