Περιεχόμενο
Στις χημικές αντιδράσεις που καταλύονται από ένα ένζυμο, το ένζυμο χαμηλώνει την ποσότητα ενέργειας ενεργοποίησης που απαιτείται από την προσωρινή σύνδεση με το υπόστρωμα και την περιστροφή του σε μία τεταμένη κατάσταση. Ο k (καταλύτης) ή "kcat" για την αντίδραση αναφέρεται στην ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση σταθερά για την ταχύτητα με την οποία ένα συγκεκριμένο ένζυμο μπορεί να μεταβολίσει ένα υπόστρωμα σε ένα μόριο προϊόντος. Για να υπολογιστεί το kcat, οι επιστήμονες αρχικά αναμειγνύουν διάφορους δοκιμαστικούς σωλήνες με ποικίλες συγκεντρώσεις υποστρώματος (γνωστό ως «ενζυματική δοκιμασία») και τις δοκιμάζουν σε σταθερά χρονικά διαστήματα με φασματοφωτόμετρο για τη μέτρηση των αυξανόμενων συγκεντρώσεων των μορίων του προϊόντος. Τα δεδομένα αυτά σχεδιάζονται στη συνέχεια σε ένα γράφημα και αναλύονται.
Υπολογισμός αρχικών ταχυτήτων
Σχεδιάστε ένα γράφημα συγκέντρωσης προϊόντος έναντι χρόνου για τα δεδομένα από τον πρώτο δοκιμαστικό σωλήνα ενζυματικών δοκιμασιών. Σημείωση: ο οριζόντιος άξονας πρέπει να είναι "χρόνος" και ο κάθετος άξονας πρέπει να είναι "συγκέντρωση προϊόντος".
Υπολογίστε τη γραμμή γραμμικής παλινδρόμησης για τα σημεία δεδομένων που παρουσιάσατε στην Ενότητα 1, Βήμα 1. Ενώ οι αριθμομηχανές Excel και γραφήματα μπορούν εύκολα να προσδιορίσουν αυτό το γραμμικό μοντέλο, μπορείτε να υπολογίσετε την κλίση των γραμμών παλινδρόμησης διαιρώντας τη διαφορά στη συγκέντρωση του προϊόντος μεταξύ γειτονικών δεδομένων τα σημεία από τη διαφορά τους στο χρόνο.
Καταγράψτε την κλίση της γραμμικής γραμμής παλινδρόμησης από την Ενότητα 1, Βήμα 2 ως "αρχική ταχύτητα αντίδρασης (Vo)." Σημείωση: Στο μοντέλο γραμμής παλινδρόμησης "= m + b", ο συντελεστής "m" είναι η κλίση.
Επαναλάβετε τα βήματα 1, 2 και 3 για τα υπόλοιπα δοκιμαστικά σωληνάρια στη δοκιμασία.
Υπολογισμός Vmax
Σχεδιάστε το αντίστροφο της συγκέντρωσης υποστρώματος για κάθε δοκιμαστικό σωλήνα έναντι του αντίστροφου της αρχικής ταχύτητας αντίδρασης (από το τμήμα 1, βήμα 4). Για παράδειγμα, εάν η αρχική ταχύτητα ενός δοκιμαστικού σωλήνα με αρχική συγκέντρωση υποστρώματος 50 μικρομορίων (μΜ) ήταν 80 μΜ / δ, τα αντίστροφα θα ήταν 1/50 μΜ για τη συγκέντρωση υποστρώματος και 1/80 μΜ / δ για την αρχική ταχύτητα. Σημείωση: η αντίστροφη συγκέντρωση υποστρώματος πρέπει να βρίσκεται στον οριζόντιο άξονα και η αντίστροφη αρχική ταχύτητα πρέπει να βρίσκεται στον κατακόρυφο άξονα.
Σημείωση: Η συγκέντρωση υποστρώματος πρέπει να είναι στον οριζόντιο άξονα και η αρχική ταχύτητα αντίδρασης πρέπει να είναι στον κατακόρυφο άξονα.
Καθορίστε τη γραμμή γραμμικής παλινδρόμησης για το γράφημα που σχεδιάσατε στην Ενότητα 2, Βήμα 1. Σημείωση: επειδή θα χρειαστεί να γνωρίζετε τη διασταύρωση y για τη γραμμή παλινδρόμησης, θα πρέπει να εισαγάγετε τα σημεία από την Ενότητα 2, Βήμα 1 είτε στο Excel είτε σε ένα και να χρησιμοποιήσετε την ενσωματωμένη λειτουργικότητα μοντελοποίησης παλινδρόμησης.
Διαχωρίστε 1 από την y-διασταύρωση από τη γραμμή γραμμικής παλινδρόμησης. Αυτό θα σας δώσει την τιμή του αντίστροφου του Vmax, της μέγιστης ταχύτητας αντίδρασης για το ένζυμο. Σημείωση: εάν το μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης παίρνει τη μορφή "= m + b", τότε η τιμή του "b" θα είναι το y-τομή. Διαχωρίστε 1 με "b" για να υπολογίσετε το αντίστροφο του Vmax.
Χωρίστε 1 από το αποτέλεσμα από την Ενότητα 2, Βήμα 3 για να υπολογίσετε την πραγματική τιμή του Vmax.
Προσδιορίστε τη συγκέντρωση του ενζύμου στην αρχική δοκιμασία (βλέπε ακατέργαστα δεδομένα). Σημείωση: η συγκέντρωση ενζύμων είναι η ίδια για όλους τους δοκιμαστικούς σωλήνες. μόνο οι συγκεντρώσεις υποστρώματος ποικίλουν στην ανάλυση.
Διαχωρίστε το Vmax (από την Ενότητα 2, Βήμα 4) με τη συγκέντρωση ενζύμων (από την Ενότητα 2, Βήμα 5). Το αποτέλεσμα είναι η τιμή του Kcat.