Περιεχόμενο
- Πώς λειτουργεί η ηλεκτροφόρηση πηκτής
- Μια βασική διαδικασία ηλεκτροφόρησης
- Προσδιορισμός μήκους των άγνωστων θραυσμάτων
Όταν πρόκειται για τη μέτρηση του μήκους των θραυσμάτων DNA, τα οποία είναι πολύ μικρότερα από τα κύτταρα, οι μικροβιολόγοι χρειάζονται ένα τέχνασμα και η πιο κατάλληλη είναι ηλεκτροφόρηση πηκτής. Αυτή η μέθοδος βασίζεται στο γεγονός ότι τα θραύσματα ϋΝΑ φορτίζονται και είναι μια εναλλακτική λύση σε ακριβότερες μεθόδους, όπως κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, η οποία ήταν υπεύθυνη για την ανακάλυψη της δομής διπλής έλικας του DNA.
Πώς λειτουργεί η ηλεκτροφόρηση πηκτής
Επειδή τα μόρια ϋΝΑ φορτίζονται, επηρεάζονται από ένα ηλεκτρικό ρεύμα. Όταν τα τοποθετείτε σε ένα ουδέτερο πήκτωμα και τοποθετείτε ένα ρεύμα κατά μήκος της γέλης, τα μόρια μεταναστεύουν προς το θετικό ηλεκτρόδιο (άνοδος). Επειδή τα μόρια DNA διαφορετικών μεγεθών φέρουν το ίδιο φορτίο, τα μικρότερα ταξιδεύουν γρηγορότερα, έτσι αυτή η διαδικασία διαχωρίζει τα μόρια σε ζώνες που μπορούν να συγκριθούν με δείγματα γνωστών μεγεθών.
Μια βασική διαδικασία ηλεκτροφόρησης
Το πήκτωμα συνήθως κατασκευάζεται από αγαρόζη, έναν πολυσακχαρίτη ο οποίος όταν θερμαίνεται σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα σχηματίζει ένα ημιστερεό, ελαφρώς πορώδες πήκτωμα. Στο ένα άκρο, το πήκτωμα σχηματίζει μικροσκοπικές εσοχές που ονομάζονται φρεάτια όπου ο ερευνητής τοποθετεί τα δείγματα DNA υπό μελέτη, μαζί με δείγματα αναφοράς γνωστού μήκους, που ονομάζονται DNA σκάλα. Τα μήκη των θραυσμάτων της κλίμακας έχουν προκαθοριστεί με άλλη μέθοδο, όπως κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ.
Όταν το πήγμα βυθίζεται σε ένα αγώγιμο διάλυμα και εφαρμόζεται τάση, τα θραύσματα αρχίζουν να μεταναστεύουν μέσω του πηκτώματος - τα μικρότερα πρώτα και τα μεγαλύτερα, πιο αργά πίσω. Τελικά σχηματίζονται σε ζώνες που μοιάζουν με φάσμα ανάλογα με το μέγεθος.
Μόλις συμβεί αυτό, ο ερευνητής σβήνει την ισχύ, εγχέει το πήκτωμα με βαφή σύνδεσης DVA και εξετάζει τα δείγματα υπό υπεριώδες φως. Χρησιμοποιώντας τη σκάλα ως αναφορά, ο ερευνητής μπορεί να προσδιορίσει το μέγεθος καθενός από τα θραύσματα σε μια ορατή ζώνη. Μόνο ζώνες είναι ορατές - μεμονωμένα θραύσματα DNA είναι πολύ μικρά για να τα δουν.
Προσδιορισμός μήκους των άγνωστων θραυσμάτων
Οι πιθανότητες δεν είναι ότι κάθε μπάντα σε ένα δείγμα ζευγαρώνει με μια ταινία στη σκάλα, έτσι ώστε να προσδιοριστούν τα μεγέθη αυτών των άγνωστων θραυσμάτων, οι επιστήμονες συνήθως σχεδιάζουν ένα γράφημα. Στον άξονα x είναι η απόσταση που διανύεται από κάθε ζώνη στη σκάλα σε χιλιοστά, ενώ στον άξονα y είναι το μέγεθος κάθε ζώνης. Όταν τα σημεία συνδέονται με καμπύλη, το μέγεθος οποιασδήποτε ζώνης μπορεί να υπολογιστεί από την καμπύλη αφού μετρηθεί η απόσταση που διανύθηκε από τη ζώνη αυτή σε χιλιοστά.