Περιεχόμενο
- TL · DR (Πολύ μακρύ;
- Ρυθμιστικό διάλυμα και αλάτι
- Διαλυτικά απορρυπαντικά
- Χηλικούς παράγοντες και αναστολείς
- Αλκαλική λύση
Η λέξη Lyse είναι μια λέξη που προέρχεται από την ελληνική γλώσσα και απλώς σημαίνει "να χωρίσει" ή "να σκάσει". Οι λόγοι σχετίζονται με το τι συμβαίνει με τα κύτταρα σε ένα buffer λύσης, μια λύση που τους διαλύει για να εξαγάγουν το περιεχόμενό τους. Οι επιστήμονες χρησιμοποιούν ρυθμιστικά λύσης όταν εξάγουν DNA ή πρωτεΐνες από κύτταρα για ανάλυση, ειδικά στην περίπτωση των βακτηριδίων. Ο τύπος του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης κυττάρων ποικίλει ανάλογα με το είδος του πειράματος, αν και οι ακόλουθες είναι μερικές κοινές επιλογές.
TL · DR (Πολύ μακρύ;
Τα ρυθμιστικά διαλύματα λύσης βοηθούν στη θραύση των ανοικτών κυψελίδων, έτσι ώστε το περιεχόμενό τους να μπορεί να προσεγγιστεί ή να αφαιρεθεί Μερικά παραδείγματα περιλαμβάνουν άλατα, απορρυπαντικά, παράγοντες χηλίωσης και αναστολείς και μερικά αλκαλικά χημικά.
Ρυθμιστικό διάλυμα και αλάτι
Τα ρυθμιστικά διαλύματα σταθεροποιούν το pH ενώ τα κύτταρα διασπώνται. Το Tris-HCL βρίσκεται ως μία από τις συνηθέστερες χημικές ουσίες για ρύθμιση σε ρΗ 8. Το HEPES είναι ένα άλλο κοινό χημικό ρυθμιστικό σε αυτά τα πειράματα. Το άλας χλωριούχου νατρίου μπορεί επίσης να αυξήσει την ιοντική ισχύ, τη συνολική συγκέντρωση διαλελυμένων ουσιών εκτός των κυττάρων. Αυτό το τελευταίο σημείο έχει κάποια σημασία αφού το νερό μπορεί να διαχέεται διαμέσου κυτταρικών μεμβρανών από περιοχές με χαμηλή συγκέντρωση διαλελυμένης ουσίας σε περιοχές με υψηλή συγκέντρωση διαλελυμένης ουσίας.
Διαλυτικά απορρυπαντικά
Τα απορρυπαντικά διαλύουν τις κυτταρικές μεμβράνες έτσι ώστε τα περιεχόμενα των κυττάρων να μπορούν να διαφύγουν. Η εγκεφαλική και η αμφιπαθική μοριακή δομή (δηλ. Μόρια με ένα άκρο που αλληλεπιδρά εύκολα με μόρια νερού ενώ το άλλο υδρόφοβο ή «δεν φοβίζει το νερό» τέλος). Μπορούν να διαλύσουν λίπη σχηματίζοντας μικκύλια, μικρά συστάδες όπου οι υδρόφοβες ουρές των μορίων απορρυπαντικού δείχνουν προς τα μέσα προς τα μόρια λίπους. Τα κοινά απορρυπαντικά περιλαμβάνουν δωδεκυλοθειικό νάτριο ή SDS, ΝΡ-40 και tritonX.
Χηλικούς παράγοντες και αναστολείς
Τα ρυθμιστικά λύσης τυπικά περιλαμβάνουν επίσης χηλικούς παράγοντες όπως αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (ΕϋΤΑ) ή αιθυλενογλυκόλη τετραοξικό οξύ (EGTA). Αυτές οι χημικές ουσίες συνδέονται με μεταλλικά ιόντα με δύο θετικά φορτία (π.χ. μαγνήσιο και ασβέστιο), καθιστώντας τα έτσι μη διαθέσιμα για άλλες αντιδράσεις. Πολλές ράβδοι ϋΝΑ (πρωτεΐνες που μασώνουν το DNA) και πρωτεάσες (πρωτεΐνες που περικόπτουν άλλες πρωτεΐνες) χρειάζονται ιόντα μαγνησίου για να λειτουργήσουν, οπότε στέλνοντας τους αυτό το βασικό συστατικό, το EDTA και η EGTA βοηθούν στη μείωση του επιπέδου δραστικότητας πρωτεάσης ή DNAse. Ωστόσο, δεν αποκλείεται εντελώς, και ορισμένες πρωτεάσες δεν εξαρτώνται από συμπαράγοντες μαγνησίου, έτσι ώστε τα ρυθμιστικά διαλύματα λύσης μερικές φορές περιλαμβάνουν επίσης χημικές ουσίες που ονομάζονται αναστολείς πρωτεάσης, οι οποίες δεσμεύονται με πρωτεάσες και εμποδίζουν τη σωστή λειτουργία τους.
Αλκαλική λύση
Η αλκαλική λύση, μια πολύ κοινή τεχνική για τον καθαρισμό πλασμιδίων από βακτήρια, περιλαμβάνει τρεις λύσεις. Η πρώτη περιέχει γλυκόζη, ρυθμιστικό διάλυμα τρις-ΗΟΙ, ΕϋΤΑ και RNAses. Η γλυκόζη δημιουργεί υψηλή συγκέντρωση διαλυτής ουσίας έξω από τα βακτηρίδια, έτσι ώστε να γίνει λίγο φτωχή, γεγονός που τους καθιστά ευκολότερο να λυθούν. Η λειτουργία EDTA και tris-HCL έχει ήδη περιγραφεί, ενώ η RNAse θα μασήσει οποιοδήποτε RNA μέσα στο κύτταρο για να το βγάλει έξω. Η δεύτερη λύση διαλύει πραγματικά τα κύτταρα. Αυτή περιέχει το απορρυπαντικό SDS και το NaOH, το οποίο αυξάνει το pH σε 12 ή παραπάνω, μετουσιώνει τις πρωτεΐνες στο εσωτερικό του κυττάρου και αναγκάζει το DNA να χωριστεί σε μονές αλυσίδες. Το τρίτο διάλυμα περιέχει οξικό κάλιο για να αποκαταστήσει το pH σε ένα πιο ουδέτερο επίπεδο, έτσι ώστε οι κλώνοι πλασμιδικού ϋΝΑ μπορούν να επανέλθουν μαζί. Εν τω μεταξύ, οι μετουσιωμένες πρωτεΐνες συσσωματώνονται και καθιζάνουν, ενώ τα ιόντα δωδεκυλο-θειικού άλατος ενώνονται μαζί με τα ιόντα καλίου για να σχηματίσουν μια αδιάλυτη ένωση, η οποία επίσης καθιζάνει από το διάλυμα.