Περιεχόμενο
- Η ηλεκτροφόρηση έχει περιορισμένη ανάλυση δειγμάτων
- Οι μετρήσεις ηλεκτροφορήσεως δεν είναι ακριβείς
- Απαιτείται ουσιαστικό αρχικό δείγμα
- Μόνο ορισμένα μόρια μπορούν να απεικονιστούν
- Η ηλεκτροφόρηση είναι χαμηλή
Η ηλεκτροφόρηση του πηκτώματος είναι μια τεχνική όπου τα βιολογικά μόρια διαχωρίζονται το ένα από το άλλο και εντοπίζονται στη βιολογική έρευνα ή στην ιατρική διάγνωση. Από την ανάπτυξή τους στη δεκαετία του '70, αυτές οι τεχνικές ήταν ανεκτίμητες για την αναγνώριση γονιδίων (DNA) και γονιδιακών προϊόντων (RNA και πρωτεϊνών) ερευνητικού ενδιαφέροντος. Τα τελευταία χρόνια έχουν προκύψει νεώτερες τεχνικές που δίνουν μεγαλύτερη εξειδίκευση και λεπτομέρειες για το τι συμβαίνει στα συστήματα διαβίωσης. Ενώ αυτά δεν έχουν αντικαταστήσει τεχνικές ηλεκτροφόρησης και οι προηγμένοι χειρισμοί μπορούν να επεκτείνουν τη βιωσιμότητα της τεχνικής, είναι σημαντικό να συνειδητοποιήσουμε ποια ηλεκτροφόρηση πηκτής μπορεί και δεν μπορεί να κάνει.
Η ηλεκτροφόρηση έχει περιορισμένη ανάλυση δειγμάτων
Η ηλεκτροφόρηση είναι συγκεκριμένη σε ό, τι ιστούς έχετε δειχθεί. Για παράδειγμα, εάν εκτελέσετε ένα στύπωμα Southern (έναν τύπο ηλεκτροφόρησης) σε ένα μανδύα, ψάχνετε γονίδια από τα επιθηλιακά κύτταρα του μάγου σας και πουθενά αλλού στο σώμα σας. Κάποιες φορές, αυτό μπορεί να είναι επωφελές, αλλά οι ερευνητές ενδιαφέρονται συχνά για πιο εκτεταμένα αποτελέσματα.
Τεχνικές όπως η υβριδοποίηση ίη situ (ISH) μπορούν να πάρουν ένα τμήμα ιστού και να αναλύσουν την έκφραση γονιδίων σε κάθε μικρή περιοχή αυτού του δείγματος.Έτσι, οι ερευνητές μπορούν να εξετάσουν κάθε περιοχή του εγκεφάλου σε δείγμα με ISH, ενώ οι τεχνικές ηλεκτροφόρησης μπορούν να εξετάσουν μόνο μερικές περιοχές κάθε φορά.
Οι μετρήσεις ηλεκτροφορήσεως δεν είναι ακριβείς
Η ηλεκτροφόρηση του πηκτώματος μπορεί να διαχωρίζει αποτελεσματικά παρόμοιες πρωτεΐνες με διαφορετικά βάρη (αυτή είναι μια τεχνική που ονομάζεται Western blotting). Μπορεί να τα διαχωρίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια μέσω μιας τεχνικής γνωστής ως 2d ηλεκτροφόρηση. αυτό είναι συνηθισμένο στην πρωτεϊνωματική.
Δυστυχώς, όλες οι μετρήσεις που έγιναν από αυτή την τεχνική είναι ημιποσοτικές στην καλύτερη περίπτωση. Για να ληφθεί η ακριβής μάζα (βάρος) πρωτεϊνών, πρέπει να χρησιμοποιηθεί φασματοσκοπία μάζας μετά την καθαρισμό της πρωτεΐνης με ηλεκτροφόρηση. Περαιτέρω, η σύγκριση των σχετικών ποσοτήτων διαφορετικών μορίων εξαρτάται από την πυκνότητα ζώνης (σκοτάδι) διαφόρων κηλίδων επί της γέλης. Αυτή η μέθοδος έχει κάποιο βαθμό σφάλματος και τα δείγματα συνήθως εκτελούνται πολλές φορές για να έχουν καθαρά αποτελέσματα.
Απαιτείται ουσιαστικό αρχικό δείγμα
Η ηλεκτροφόρηση είναι μια τεχνική απομόνωσης και οπτικής αναγνώρισης διαφορετικών βιομορίων. Αυτό γίνεται με τη διέλευση ενός ηλεκτρικού ρεύματος διαμέσου του πηκτώματος σε ξεχωριστά φορτισμένα μόρια διαφορετικών βαρών. Αν το μόριο που ενδιαφέρεστε δεν είναι αρκετά κοινό, η ζώνη του θα είναι σχεδόν αόρατη και δύσκολο να μετρηθεί.
Το DNA και το RNA μπορούν να ενισχυθούν κάπως πριν από την ηλεκτροφόρηση, αλλά δεν είναι πρακτικό να γίνει αυτό με τις πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου, απαιτείται ένα μεγάλο δείγμα ιστού για τη διεξαγωγή αυτών των προσδιορισμών. Αυτό μπορεί να περιορίσει τη χρησιμότητα της τεχνικής, ειδικά στην ιατρική ανάλυση. Είναι σχεδόν αδύνατο να εκτελεστεί ηλεκτροφόρηση σε δείγματα από ένα μόνο κύτταρο. η κυτταρομετρία ροής και η ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιούνται συχνότερα για την εκτίμηση της έκφρασης πρωτεϊνών κυττάρου-κυττάρου. Μια τεχνική που ονομάζεται PCR είναι εξαιρετική στην ακριβή μέτρηση μικρών ποσοτήτων RNA.
Μόνο ορισμένα μόρια μπορούν να απεικονιστούν
Η ηλεκτροφόρηση είναι εξαιρετική στο διαχωρισμό και την αναγνώριση των μεσαίου έως μεγάλου μεγέθους βιομορίων. Ωστόσο, πολλά από τα μόρια που οι ερευνητές επιθυμούν να εξετάσουν είναι μικρότερα. οι μικρές ορμόνες, οι νευροδιαβιβαστές και τα ιόντα δεν μπορούν να μετρηθούν με ηλεκτροφόρηση. Αυτό είναι για δύο λόγους: δεν αντιδρούν σωστά με την προετοιμασία ηλεκτροφόρησης (συνήθως μια τεχνική που ονομάζεται SDS PAGE) και, ακόμα κι αν το έκαναν, είναι πολύ μικρές για να διαχωριστούν σωστά και θα βγάλουν το κάτω μέρος της γέλης. Αυτά τα μόρια μετριούνται αντ 'αυτού με τεχνικές όπως RIAAs (ραδιοανοσοδοκιμές) και ELISAs (ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία).
Η ηλεκτροφόρηση είναι χαμηλή
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής είναι γενικά χαμηλή, πράγμα που σημαίνει ότι δεν παράγει δεδομένα ιδιαίτερα γρήγορα. Ηλεκτροφόρηση αντίθεσης, όπου μπορείτε να δείτε μια μικρή χούφτα μόρια RNA κάθε φορά, με PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης), η οποία μπορεί ταυτόχρονα να αξιολογήσει χιλιάδες δείγματα. Ομοίως, η κυτταρομετρία ροής μπορεί να λάβει μετρήσεις από χιλιάδες μεμονωμένα κύτταρα και να κάνει περίπλοκες συσχετίσεις, ενώ η ηλεκτροφόρηση εξετάζει μαζικά τα κύτταρα και δεν μπορεί να κάνει τέτοιες λεπτές διακρίσεις. Η PCR και η κυτταρομετρία ροής αντιπροσωπεύουν μαζικά παράλληλες και σειριακές διαδικασίες αντιστοίχως και αμφότερες υπερβαίνουν τις ικανότητες ηλεκτροφόρησης για τη δημιουργία ερευνητικών δεδομένων.