Περιεχόμενο
- Το Matrix Gel
- Το Επιμελητήριο Ηλεκτροφόρησης
- Προετοιμασία του DNA
- Ενεργοποιήστε την τροφοδοσία
- Τελικά βήματα
Η ηλεκτροφόρηση του πηκτώματος είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται στα εργαστήρια για τη μέτρηση και την ταξινόμηση των κλώνων του DNA. Είναι απαραίτητο επειδή το DNA κάτω από κανονικές συνθήκες είναι πολύ μικρό για να χειριστεί, ακόμα και όταν παρατηρείται χρησιμοποιώντας τα περισσότερα μικροσκόπια. Το εργαστήριο ηλεκτροφόρησης πηκτής χρησιμοποιεί μια σχετικά απλή διαδικασία και η ίδια βασική τεχνική μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό μεμονωμένων πρωτεϊνών.
Το Matrix Gel
Για να ξεκινήσετε τη διαδικασία ηλεκτροφόρησης πηκτής, πρέπει πρώτα να δημιουργήσετε το τζελ. Τυπικά, οι πηκτές κατασκευάζονται σε λεπτά φύλλα χρησιμοποιώντας μια ουσία που ονομάζεται αγαρόζη. Η κονιοποιημένη αγαρόζη τοποθετείται σε μια φιάλη, ακολουθούμενη από ένα διάλυμα άλατος νερού που ονομάζεται ρυθμιστικό διάλυμα. Αυτό το μίγμα αγαρόζης και ρυθμιστικού διαλύματος θερμαίνεται μέχρις ότου οι δύο ουσίες τήξουν μαζί, και στη συνέχεια χύνεται σε ένα καλούπι διαμόρφωσης. Μια συσκευή που ονομάζεται χτένα τοποθετείται έπειτα στο ένα άκρο του καλουπιού προτού κρυώσει το πήκτωμα. Όταν η γέλη ψύχεται, η χτένα απομακρύνεται αφήνοντας μικρές σχισμές που θα χρησιμοποιηθούν για τη συγκράτηση δειγμάτων DNA.
Ένα ειδικό χαρακτηριστικό του ψυχόμενου μείγματος αγαρόζης (που ονομάζεται μήτρα πηκτής) προέρχεται από το γεγονός ότι δημιουργείται με αλμυρό νερό. Όταν ηλεκτροδοτηθεί, η μήτρα θα γίνει αγώγιμη, επιτρέποντας την ροή ηλεκτρικής ενέργειας κατά μήκος της. Μια άλλη ειδική ιδιότητα της μήτρας πηκτής είναι η παρουσία κανονικών, μικροσκοπικών οπών. Αυτές οι οπές θα επιτρέψουν σε κλώνους DNA να ταξιδέψουν μέσω της μήτρας πηκτής και να διευκολύνουν τη διαδικασία διαλογής.
Το Επιμελητήριο Ηλεκτροφόρησης
Το επόμενο βήμα σας είναι να δημιουργήσετε ένα θάλαμο ηλεκτροφόρησης. Πρόκειται για ένα μικρό ορθογώνιο κουτί, καλωδιωμένο με θετική και αρνητική ηλεκτρική σύνδεση σε κάθε άκρο. Τα θαλάμη είναι συνήθως ρηχά, αρκετά μικρά για να χωρέσουν σε ένα τραπέζι, και χτίστηκαν από διαυγή υλικά όπως η πλεξιγκλάς.
Το διάλυμα άλατος νερού χύνεται στον πυθμένα του θαλάμου ηλεκτροφόρησης και η μήτρα πηκτής είναι βυθισμένη ελαφρά εντός αυτού του διαλύματος. Το αλμυρό νερό εξυπηρετεί δύο σκοπούς: βοηθώντας τη ροή ηλεκτρικής ενέργειας και διατηρώντας τη μήτρα πηκτής υγρή. Δεδομένου ότι το DNA προωθείται από αρνητικό φορτίο, τοποθετήστε το πλέγμα σας έτσι ώστε τα δείγματά σας να βρίσκονται δίπλα στην αρνητική ηλεκτρική σύνδεσή σας.
Προετοιμασία του DNA
Στη συνέχεια, παρασκευάζονται δείγματα DNA. Δεδομένου ότι το DNA σε διάλυμα είναι εντελώς αδύνατο να δει κανείς, ένας χρωστικός παράγοντας που ονομάζεται ρυθμιστικό φόρτωσης προστίθεται σε κάθε μεμονωμένο δείγμα. Αυτός ο παράγοντας επίσης πυκνώνει τη λύση του DNA, καθιστώντας τον λιγότερο δραστικό και πιο λειτουργικό. Χρησιμοποιώντας μια πιπέτα, μεταφέρετε ένα δείγμα διαλύματος ϋΝΑ σε κάθε εναλλασσόμενη σχισμή στη μήτρα πηκτής. Στην κενή σχισμή μεταξύ κάθε δείγματος, τοποθετήστε κάποια λύση του DNA του οποίου το μήκος γνωρίζετε ήδη (ονομάζεται πρότυπο DNA) για έλεγχο και σύγκριση πειράματος.
Ενεργοποιήστε την τροφοδοσία
Τώρα, ενεργοποιήστε τον θάλαμο ηλεκτροφόρησης. Υπό αρνητική ισχύ, τα δείγματα DNA σας θα εξαναγκαστούν σε όλη τη διάρκεια του θαλάμου. Μικρά σκέλη του DNA θα κινούνται πιο γρήγορα μέσω του πηκτώματος πηκτώματος, και σε σύντομο χρονικό διάστημα θα διαχωρίζονται από μακρύτερους, βραδύτερους κλώνους. Η βαφή στον παράγοντα χρωματισμού σάς επιτρέπει να παρακολουθείτε την τροχιά του DNA. Δεν θα μπορείτε να δείτε μεμονωμένα σκέλη DNA, αλλά σκέλη του ίδιου μήκους θα συγκεντρωθούν μαζί.
Τελικά βήματα
Όταν το DNA έχει διαχωριστεί, η μήτρα απομακρύνεται από τον θάλαμο ηλεκτροφόρησης. Το DNA στη συνέχεια κηλιδώνεται για να επιτρέπει ευκολότερη μέτρηση και εξέταση.