Περιεχόμενο
Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) είναι μια εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό και την αναγνώριση ενώσεων. Είναι ένας τύπος χρωματογραφίας στήλης που βασίζεται σε διαφορετικές πολικότητες των ενώσεων σε ένα διάλυμα για να τις διαχωρίσει. Η HPLC διαφέρει από την τυποποιημένη χρωματογραφία στήλης επειδή χρησιμοποιεί πίεση για να πιέσει πιο γρήγορα το διάλυμα μέσω της στήλης και επομένως παράγει ταχύτερα και μερικές φορές πιο ακριβή αποτελέσματα. Ο στόχος είναι να διαχωριστούν οι ενώσεις στη στήλη και να βγουν ξεχωριστά.
Συνεργασία
Λόγω της ταχύτητας της HPLC και της εξάρτησης από διαφορετικές πολικότητες των ενώσεων, δύο ενώσεις με παρόμοια δομή και πολικότητα μπορούν να εξέλθουν από τη συσκευή χρωματογραφίας ταυτόχρονα ή σχεδόν ταυτόχρονα. Αυτό είναι γνωστό ως coelution. Η συγχώνευση καθιστά τον προσδιορισμό ακριβώς ποιο τμήμα του μείγματος εκλούεται σε ποιο σημείο είναι δύσκολο.
Προσροφημένες ενώσεις
Η HPLC τυπικά χρησιμοποιεί μια γυάλινη στήλη γεμάτη με σφαιρίδια κατασκευασμένα από διαφορετικά υλικά. Τα μίγματα που αναγκάζονται μέσω της στήλης έχουν χημικές ουσίες που δεσμεύονται με διαφορετικές αντοχές στα σφαιρίδια. Η δύναμη της δέσμευσης, η οποία εξαρτάται από την ομοιότητα της πολικότητας, καθορίζει πόσο καιρό θα δεσμεύεται το χημικό με το σφαιρίδιο πριν απελευθερωθεί. Ορισμένες ενώσεις δεσμεύονται τόσο έντονα ώστε ουσιαστικά δεν απελευθερώνονται ουσιαστικά από τα σφαιρίδια στη στήλη και ποτέ δεν μετρώνται στο διάλυμα που εξέρχεται από τη στήλη.
Κόστος
Τυπικές τεχνικές εργαστηριακού διαχωρισμού περιλαμβάνουν ανάπτυξη ανιχνεύσεως ή μεθόδου διαχωρισμού και στη συνέχεια εφαρμογή αυτής της ανιχνεύσεως για διαχωρισμό μεμονωμένων ενώσεων από διάλυμα. Ωστόσο, αυτό συνήθως οδηγεί σε πολλαπλές λύσεις που πρέπει επίσης να υποβληθούν σε διαδικασίες, με αποτέλεσμα μια εκθετική αύξηση της πολυπλοκότητας. Αν και η HPLC μπορεί συχνά να απλοποιήσει και να επιταχύνει αυτή τη διαδικασία, το κόστος ανάπτυξης μιας συσκευής HPLC μπορεί να γίνει τεράστιο. Η ανάπτυξη μιας συσκευής HPLC, αν και πολύ πιο αποτελεσματική, είναι πολύ πιο δαπανηρή από την ανάπτυξη άλλων δοκιμασιών για τον διαχωρισμό των ενώσεων. Αυτό δεν το καθιστά οικονομικά βιώσιμο για πολλά μικρά ιδιωτικά εργαστήρια.
Περίπλοκο
Η HPLC δεν χρησιμοποιείται μόνο για τον διαχωρισμό απλών ενώσεων, χρησιμοποιείται επίσης για την απομόνωση συγκεκριμένων πρωτεϊνών από ένα κυτταρικό μίγμα. Σε αυτή την περίπτωση τα σφαιρίδια στη στήλη συνήθως επικαλύπτονται με ένα αντίσωμα ειδικό για την πρωτεΐνη που πρέπει να συλλέξετε. Οι πρωτεΐνες δεσμεύουν τα αντισώματα και το υπόλοιπο διάλυμα διέρχεται μέσω της στήλης, κατόπιν οι πρωτεΐνες απελευθερώνονται χρησιμοποιώντας άλλο διάλυμα και συλλέγονται. Αυτό απαιτεί από έναν εξειδικευμένο τεχνικό να παρακολουθεί τη στήλη ανά πάσα στιγμή και να βεβαιώνεται ότι η διαδικασία λειτουργεί ακριβώς όπως είχε προγραμματιστεί.