Περιεχόμενο
Όταν εργάζεστε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), η καλή βαθμονόμηση είναι απολύτως απαραίτητη για την εξασφάλιση αξιόπιστων και ποιοτικών αποτελεσμάτων. Η σωστή βαθμονόμηση ενός οργάνου HPLC αρχίζει με τη δημιουργία ενός κατάλληλου προτύπου βαθμονόμησης. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η βαθμονόμηση στην πραγματικότητα απαιτεί μια σειρά προτύπων αυξανόμενης συγκέντρωσης προκειμένου να παράγει αυτό που είναι γνωστό ως καμπύλη βαθμονόμησης. Αυτή είναι μια γραφική παράσταση και σχετική εξίσωση η οποία περιγράφει τη σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης του χημικού που ελέγχεται και της απόκρισης του ανιχνευτή HPLC.
Προσδιορίστε τη χημική ουσία που θέλετε να δοκιμάσετε για τη χρήση της HPLC ("αναλύτη"). Για παράδειγμα, μπορεί να θέλετε να δοκιμάσετε μια σειρά αναψυκτικών για την περιεκτικότητα σε φρουκτόζη, οπότε η φρουκτόζη θα είναι η αναλυόμενη ουσία.
Λαμβάνεται ποσότητα χημικής ουσίας αναλυόμενης ουσίας κατάλληλης καθαρότητας. Κανονικά η καθαρότητα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 99% και η αναλυόμενη ουσία πρέπει να αγοράζεται από μια αξιόπιστη εταιρία παροχής χημικών ουσιών. Στην περίπτωση της φρουκτόζης, για παράδειγμα, θα αγοράσατε την καθαρή φρουκτόζη από έναν χημικό πωλητή και όχι από ένα μπακάλικο.
Προσδιορίστε τις μέγιστες και ελάχιστες αναμενόμενες συγκεντρώσεις της αναλυόμενης ουσίας στα δείγματα που σκοπεύετε να δοκιμάσετε με HPLC. Στην περίπτωση των αναψυκτικών, θα εξετάσετε τις ετικέτες των ποτών και θα καθορίσετε το χαμηλότερο και το υψηλότερο περιεχόμενο φρουκτόζης στα ποτά που θα δοκιμάσετε. Λάβετε υπόψη ότι το αρχικό δείγμα (το αναψυκτικό) μπορεί να αραιωθεί ή να αλλοιωθεί με άλλο τρόπο κατά τη διάρκεια της παρασκευής για ανάλυση (ανάλογα με τη μέθοδο HPLC που χρησιμοποιείται) και έτσι η συγκέντρωση του αναλύτη στα δείγματα που πραγματικά εισάγονται στην HPLC μπορεί να τροποποιηθεί. Η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας στα δείγματα όπως εκτελείται στην HPLC πρέπει να ληφθεί υπόψη.
Προσδιορίστε τον διαλύτη στον οποίο θα διαλύσετε τον αναλύτη σας για να δημιουργήσετε πρότυπα βαθμονόμησης. Αυτός ο διαλύτης πρέπει να είναι ικανός να διαλύει σωστά την αναλυόμενη ουσία σε ένα σχετικά ευρύ φάσμα συγκέντρωσης (τουλάχιστον τόσο υψηλό όσο στα δείγματα που σκοπεύετε να δοκιμάσετε). Επίσης, αυτός ο διαλύτης θα πρέπει ιδανικά να είναι αρκετά παρόμοιος με την "κινητή φάση:" τον διαλύτη που χρησιμοποιείται για τη μεταφορά δειγμάτων μέσω του οργάνου HPLC.
Υπολογίστε την ποσότητα της αναλυόμενης ουσίας που απαιτείται για να γίνει μια "πρότυπη απόθεμα" λύση του αναλύτη. Αυτό διαπιστώνεται πολλαπλασιάζοντας την απαιτούμενη συγκέντρωση του προτύπου αποθέματος με τον επιθυμητό όγκο. Η συγκέντρωση του αναλύτη σε αυτό το διάλυμα πρέπει να είναι τουλάχιστον κατά 10% υψηλότερη από την υψηλότερη αναμενόμενη συγκέντρωση του δείγματος. Εάν η υψηλότερη αναμενόμενη συγκέντρωση φρουκτόζης σε δείγμα αναψυκτικού είναι 8 γραμμάρια / 100 χιλιοστόλιτρα, τότε το πρότυπο απόθεμα μπορεί να γίνει σε συγκέντρωση 10 γραμμαρίων φρουκτόζης / 100 χιλιοστόλιτρων. Ένας λογικός όγκος είναι 500 χιλιοστόλιτρα, οπότε απαιτούνται 8/100 mL x 500 mL = 40 γραμμάρια φρουκτόζης.
Ζυγίστε την απαιτούμενη ποσότητα αναλυόμενης ουσίας σε κατάλληλο επίπεδο ακρίβειας. Συχνά είναι κατάλληλη μια τιμή βάρους σε γραμμάρια με ακρίβεια ενός ή δύο δεκαδικών ψηφίων, αλλά μπορεί να απαιτηθεί περισσότερη ακρίβεια για μερικές μεθόδους.
Μεταφέρετε το ζυγισμένο αναλύτη σε ογκομετρική φιάλη του αναγκαίου όγκου και προσθέστε τον επιθυμητό διαλύτη στο σημάδι πλήρωσης της φιάλης. Η χρήση μιας ογκομετρικής φιάλης (και όχι ενός κλιμακωτού ποτηριού, για παράδειγμα) αυξάνει την ακρίβεια της πρότυπης τιμής συγκέντρωσης του αποθέματος. Βεβαιωθείτε ότι ολόκληρη η αναλυόμενη ουσία μεταφέρεται στη φιάλη. χρησιμοποιήστε κάποιο από το διαλύτη για να το πλύνετε, αν είναι απαραίτητο.
Συμπληρώνεται η ογκομετρική φιάλη και ανακινείται ή αναστρέφεται ήπια μέχρι να διαλυθεί εντελώς η αναλυόμενη ουσία.
Πραγματοποιήστε μια σειρά μεταβαλλόμενων αραιώσεων του προτύπου αποθέματος μεταφέροντας γνωστούς όγκους του προτύπου αποθέματος σε ογκομετρικές φιάλες, χρησιμοποιώντας πιπέτες για ακριβή μεταφορά και στη συνέχεια προσθέτοντας διαλύτη. Η χαμηλότερη τυποποιημένη συγκέντρωση πρέπει να είναι κάτω από το χαμηλότερο αναμενόμενο δείγμα που πρόκειται να αναλυθεί. Στο παράδειγμα αναψυκτικού, εάν η χαμηλότερη αναμενόμενη συγκέντρωση φρουκτόζης σε ένα δείγμα είναι 2 γραμμάρια / 100 mL, τότε θα μπορούσε να γίνει πρότυπο 1 γραμμάριο / 100 mL. Αυτό θα γινόταν με δεκαπλάσια αραίωση του αποθέματος προτύπου. Η τυποποιημένη σειρά θα πρέπει να περιλαμβάνει συνολικά 5 ή 6 συγκεντρώσεις, επομένως απαιτούνται πρόσθετες αραιώσεις για την παραγωγή προτύπων ίσως 3, 5 και 8 γραμμαρίων φρουκτόζης / mL. Τώρα έχετε μια σειρά τυποποιημένων λύσεων με τις οποίες μπορείτε να βαθμονομήσετε την HPLC.