Περιεχόμενο
Στην ηλεκτροφόρηση πηκτής, δείγματα DNA ή πρωτεϊνών διαχωρίζονται - τυπικά με βάση το μέγεθος - με την εφαρμογή ενός ηλεκτρικού πεδίου που τους αναγκάζει να μεταναστεύσουν μέσω πηκτής. Η χρήση της ηλεκτροφόρησης πηκτής είναι ρουτίνα στα εργαστήρια βιοϊατρικής έρευνας και χρησιμοποιείται για να απαντήσει σε διάφορες διαφορετικές ερωτήσεις, οπότε δεν υπάρχει πραγματικά καθολικός τρόπος για να αναλύσετε τα αποτελέσματα.
Διαφορετικές τεχνικές όπως το Western blotting, η Northern blotting και η Southern blotting, για παράδειγμα, όλες περιλαμβάνουν ηλεκτροφόρηση πηκτής.
Εάν κάνετε ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης σε δείγματα DNA, το πιο συνηθισμένο είδος διαδικασίας, θα χρειαστεί να κάνετε τουλάχιστον δύο πράγματα: 1) να διακρίνετε τα μη κομμένα πλασμίδια από τα ένθετα, τα πλασμίδια με σχισμές και τα κομμένα πλασμίδια και 2) να υπολογίσετε το μέγεθος των διαφόρων Τμήματα DNA με μια τυπική καμπύλη Excel ή αριθμομηχανή.
Ετσι δουλευει.
Ελέγξτε το σημειωματάριό σας για να προσδιορίσετε ποια δείγματα φορτώθηκαν σε ποιες λωρίδες. Όταν τοποθετήσατε τα πηγάδια για τη γέλη σας, θα πρέπει να έχετε σημειώσει την ταυτότητα κάθε λωρίδας / δείγματος.
Προσδιορίστε ποια λωρίδα περιέχει τη "σκάλα" των προτύπων DNA. Αυτά είναι θραύσματα γνωστού μήκους. η απόσταση μετανάστευσης τους μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του μεγέθους των θραυσμάτων δείγματος χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη Excel ή άλλη αριθμομηχανή.
Χρησιμοποιώντας ένα χάρακα, μετρήστε την απόσταση στην εικόνα σας από τα πηγάδια στη βαφή παρακολούθησης, η οποία θα έχει ταξιδέψει περισσότερο από οποιαδήποτε ζώνη DNA (με άλλα λόγια, θα βρίσκεται στο κάτω μέρος της γέλης). Καταγράψτε αυτόν τον αριθμό - οι μονάδες που χρησιμοποιείτε δεν είναι σημαντικές.
Μετρήστε την απόσταση της εικόνας σας από τα φρεάτια σε κάθε μία από τις ζώνες στη "σκάλα", στη συνέχεια διαιρέστε την απόσταση αυτή από την απόσταση που διανύθηκε από τη λωρίδα βαφής παρακολούθησης. Αυτός ο υπολογισμός σας δίνει τη σχετική κινητικότητα κάθε ζώνης.
Παράδειγμα: Ας υποθέσουμε ότι η μπάντα παρακολούθησης βαφής ταξίδεψε 6 ίντσες και έχουμε τρεις ζώνες που ταξίδευαν με 5, 4,5 και 3,5 ίντσες.
Ποια είναι η σχετική κινητικότητά τους; Απάντηση: Μοιραζόμαστε 5, 4,5 και 3,5 με 6 για να αποκτήσουμε σχετικές κινητικές ικανότητες 0,833, 0,75 και 0,5833.
Καταχωρίστε τις σχετικές δυνατότητες κινητικότητας στο πρόγραμμα υπολογιστικών φύλλων (Excel ή οποιοδήποτε άλλο παρόμοιο πρόγραμμα που χρησιμοποιείτε) μαζί με το μέγεθος σε κιλοβάσεις κάθε θραύσματος στη σκάλα.
Ο κατασκευαστής σας δίνει το μέγεθος κάθε θραύσματος στις σκάλες που παρέχουν, οπότε θα πρέπει να έχετε ήδη αυτές τις πληροφορίες.
Γράψτε τα δεδομένα με τη σχετική κινητικότητα στο x και το μέγεθος σε kilobases στο y.
Χρησιμοποιήστε τη συνάρτηση Trendline στο πρόγραμμα υπολογιστικού φύλλου, ώστε να ταιριάζει με μια εξίσωση στα δεδομένα. Αυτή η εξίσωση θα πρέπει να είναι μια εξίσωση ισχύος (π.χ. x ^ -2) και θα πρέπει να ταιριάζει τα δεδομένα σχετικά καλά (συντελεστής R τουλάχιστον 0,9). Αυτό δημιουργεί μια καμπύλη και μια τυπική καμπύλη Excel.
Κοιτάξτε τις ζώνες που αντιστοιχούν στα δείγματα σας.
Θυμηθείτε ότι μικρότερα θραύσματα DNA ταξιδεύουν μακρύτερα μέσω του πηκτώματος από ό, τι μεγάλα τεμάχια ϋΝΑ, επομένως τα πλησιέστερα στη βαφή παρακολούθησης θα είναι τα μικρότερα. Σημειώστε, ωστόσο, ότι εάν πλασμιδιακό (κυκλικό) DNA δεν είναι κοφτερό, θα γίνει "supercoiled" ή στριμμένο σαν ένα τηλεφωνικό καλώδιο, το οποίο θα το κάνει πραγματικά να ταξιδέψει μακρύτερα από το γραμμικό DNA του ίδιου μεγέθους.
Παρομοίως, ένα πλασμίδιο "σχισμένο" που έχει κοπεί ατελώς θα ταξιδέψει α κοντύτερος απόσταση από το γραμμικό DNA του ιδίου μεγέθους. Συνεπώς, δεν μπορείτε να υπολογίσετε το μέγεθος των μη σχισμένων πλασμιδίων από τη γέλη σας.
Ταιριάξτε τις ζώνες σε κάθε λωρίδα με την ταυτότητα του δείγματος που φορτώσατε σε αυτήν τη λωρίδα και προσδιορίστε αν αυτό που βλέπετε είναι αυτό που θα περίμενε κανείς. Αυτό θα εξαρτηθεί από τη φύση του πειράματός σας.
Εντούτοις, γενικά, εάν αφομοιώσατε ένα πλασμίδιο εισαγωγής με δύο ένζυμα περιορισμού, θα περιμένατε ότι το ένθετο θα απελευθερωθεί από το πλασμίδιο.
Δεδομένου ότι είναι πολύ μικρότερο από το πλασμίδιο, θα περίμενε κανείς να βλέπει δύο ζώνες σε αυτή τη λωρίδα, μία κοντά στην κορυφή και την άλλη κοντά στο κάτω μέρος. Ένα πλασμίδιο που κόβεται με μόνο ένα ένζυμο περιορισμού θα πρέπει να σχηματίζει μόνο μία ζώνη που ταξιδεύει λίγο πιο μακριά από το πλασμίδιο που κόβεται με δύο ένζυμα περιορισμού, αλλά δεν βρίσκεται καθόλου κοντά στο ένθετο.
Μετρήστε την απόσταση από τα πηγάδια στο κομμένο πλασμίδιο και εισάγετε ζώνες με τον χάρακά σας. Διαιρέστε τους αριθμούς αυτούς από την απόσταση που διανύθηκε από τη βαφή παρακολούθησης για να βρείτε τη σχετική κινητικότητα των ενθέτων και των πλασμιδίων που έχουν κοπεί.
Συνδέστε τη σχετική κινητικότητα των ένθετων και των κομμένων πλασμιδίων στην εξίσωση που υπολογίζεται για εσάς το πρόγραμμα υπολογιστικών φύλλων. Αυτός ο υπολογισμός θα σας δώσει μια εκτίμηση του μεγέθους αυτών των πλασμιδίων.