Περιεχόμενο
DNA
Δεσοξυριβονουκλεϊνικό οξύ και πρωτεΐνες. Το DNA είναι οργανωμένο σε μονάδες που ονομάζονται γονίδια, καθένα από τα οποία κωδικοποιεί μια συγκεκριμένη αλληλουχία RNA ή πρωτεΐνης. Τα γονίδια μελετώνται για να μάθουν για τη βιολογική δομή και λειτουργία, την εξέλιξη, τις ασθένειες και πολλές άλλες πτυχές των ζωντανών συστημάτων. Για να μελετήσουμε λεπτομερώς τα γονίδια, το DNA πρέπει να απομονωθεί και να καθαριστεί από τα κύτταρα που μας ενδιαφέρουν.
Εξόρυξη DNA
Αν και το DNA από ένα μόνο κύτταρο μπορεί να εξαχθεί και να μελετηθεί, δεν αρκεί για να το δείτε με γυμνό μάτι. Για να έχετε αρκετή ποσότητα για την περιστροφή, τόσο περισσότερα κύτταρα θα πρέπει να εργαστείτε με το καλύτερο (πολλά εκατομμύρια).
Τα ακριβή πρωτόκολλα ποικίλουν σημαντικά για να ληφθούν υπόψη τα μοναδικά χαρακτηριστικά των ειδικών δειγμάτων, αλλά τα γενικά στάδια είναι η ομογενοποίηση, η λύση, η πέψη, ο διαχωρισμός και η συλλογή. Η διαδικασία πραγματοποιείται καλύτερα σε ένα μικρό (ανάλογα με το μέγεθος του δείγματος) γυάλινο ή πλαστικό σωλήνα.
Ένα δείγμα γενικά αναμειγνύεται ή αλέθεται για να διαχωρίσει πλήρως τα κύτταρα το ένα από το άλλο. Αυτό καθιστά τα κυτταρικά συστατικά περισσότερο προσβάσιμα στα αντιδραστήρια που ακολουθούν. Στη συνέχεια προστίθενται απορρυπαντικό ή ένζυμα στο ομογενοποίημα για να λυθούν οι κυτταρικές μεμβράνες (και οι πυρηνικές μεμβράνες αν τα κύτταρα είναι ευκαρυωτικά) για να απελευθερωθεί το DNA. Σε αυτό το σημείο, το DNA περιβάλλεται από πρωτεΐνες, λιπίδια, υδατάνθρακες --- όλα όσα περιέχονται στα κύτταρα.
Μια περαιτέρω ενζυματική πέψη μπορεί να είναι απαραίτητη για να διασπάσει τις πρωτεΐνες έτσι ώστε να μην δεσμεύονται με το DNA και να παρεμβαίνουν στη συλλογή του. Το DNA διαχωρίζεται από το υπόλοιπο των κυτταρικών περιεχομένων προσθέτοντας ψυχρή, καθαρή, αιθυλική ή ισοπροπυλική αλκοόλη. Το DNA δεν είναι διαλυτό σε αυτές τις αλκοόλες, επομένως θα συμπυκνώνεται για να προσπαθήσει να ελαχιστοποιήσει την επαφή του με το αλκοόλ. Τα συμπυκνωμένα ϋΝΑ συλλέγονται στη συνέχεια, συνήθως με φυγοκέντρηση - ή με περιστροφή.
DNA Spooling
Η συλλογή ϋΝΑ με την περιστροφή είναι αποτελεσματική όταν λαμβάνεται μία μεγάλη ποσότητα DNA από μια διαδικασία εκχύλισης. Είναι επίσης μια εξαιρετική μέθοδος επίδειξης δεδομένου ότι ένα εντυπωσιακό μπάλωμα καθαρού DNA είναι σαφώς ορατό.
Για την εκκίνηση του DNA, το βήμα διαχωρισμού πρέπει να διεξαχθεί προσεκτικά. Εάν δεν ήταν ένα μέρος του μίγματος αντιδραστηρίου λύσης που είχε προηγουμένως προστεθεί, πρέπει να προστεθεί στο διάλυμα ένα συμπυκνωμένο διάλυμα άλατος (χλωριούχο νάτριο) πριν από το στάδιο προσθήκης αλκοόλης. Η ψυχρή αλκοόλη χύνεται αργά κάτω από την πλευρά του δοκιμαστικού σωλήνα για να σχηματιστεί ένα στρώμα πάνω από το υδατικό διάλυμα, αποφεύγοντας την ανάμειξη. Εάν γίνει σωστά, το αλκοόλ θα σχηματίσει το δικό του στρώμα πάνω από το αλμυρό στρώμα. Στη συνέχεια έρχεται η εκκαθάριση.
Για να συλλέξετε το DNA από το αλμυρό στρώμα, τοποθετήστε προσεκτικά μια γυάλινη ράβδο ανάδευσης μέσω του στρώματος αλκοόλης μέχρι να αγγίξει τον πυθμένα του σωλήνα. Στρίψτε αργά τη ράβδο μεταξύ των δακτύλων, ενώ παρακολουθείτε τη διεπιφάνεια μεταξύ των δύο στρωμάτων. Εάν υπάρχει αρκετό DNA, θα συγκεντρωθεί μαζί στη διεπιφάνεια μεταξύ των στρωμάτων για να σχηματιστεί μια γαλακτώδης ημιδιαφανής μάζα. Περιστρέψτε τη ράβδο για να τυλίξετε το DNA γύρω από αυτό (αυτό είναι το τμήμα εκτύλιξης) και τραβήξτε το έξω από το σωλήνα. Το DNA μπορεί να μεταφερθεί σε άλλο σωλήνα καθαρού αλκοόλ για αποθήκευση ή περαιτέρω ανάλυση.